李璋赟，汪 萍，金映紅，薛 晶，汪 陽，陳古麗，夏 俊*

（1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學(xué)院動物臨床醫(yī)學(xué)研究中心，烏魯木齊 830000；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830000）

羊傳染性膿皰（contagiousecthyma）俗稱羊口瘡（orf）、羊傳染性膿皰皮炎（contagiouspustular dermatitis，CPD），是由羊傳染性膿皰病毒引起的人畜共患病。該病主要引起羔羊口唇等部位的皮膚、黏膜形成丘疹、膿皰、潰瘍及疣狀厚痂[1]。

目前還沒有商用疫苗能夠完全預(yù)防羊傳染性膿皰病毒感染。弱毒疫苗進(jìn)行皮膚劃痕免疫能夠預(yù)防羊傳染性膿皰病毒感染[2]，但存在免疫方法繁瑣、保護(hù)期短的缺陷，在基層難以推廣使用。使用滅活疫苗對產(chǎn)前孕羊進(jìn)行免疫，羔羊可通過初乳獲得抗體[3]產(chǎn)生對羊傳染性膿皰的抵抗力。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與病毒

羔羊睪丸細(xì)胞取自20日齡雄性羔羊睪丸；病毒為新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存的羊傳染性膿皰強(qiáng)毒株。

1.2 試劑與儀器

1.3 羔羊睪丸細(xì)胞的制備

制備細(xì)胞前配置細(xì)胞生長液，500 mL MEM培養(yǎng)基中加入50 mL胎牛血清和10 mL青霉素-鏈霉素溶液，混勻置4℃?zhèn)溆谩?/p>

無菌采集20日齡雄性羔羊睪丸，用無菌剪刀和鑷子剝離睪丸外部組織，并用MEM沖洗2～3次；將清洗完畢的睪丸組織剪碎，稱重，置入無菌錐形瓶內(nèi)；按凈重的4倍加入0.25%胰酶消化液，置4℃冰箱消化12 h，待組織表面呈絨毛狀，棄消化液，用玻璃珠振搖加入細(xì)胞生長液收集細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液用4層紗布過濾后1 000 rpm離心5 min，棄去上清液，用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后將細(xì)胞懸液以適宜濃度培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)2～3 d即獲得羔羊睪丸原代細(xì)胞。

1.4 接種病毒

接種病毒前需配置維持液，在500 mL MEM培養(yǎng)基中加入10 mL胎牛血清和10 mL青霉素-鏈霉素溶液，混勻置4℃?zhèn)溆谩?/p>

取已生長至細(xì)胞瓶底70%的羔羊睪丸細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用加入10 mL青霉素-鏈霉素溶液的MEM培養(yǎng)液清洗細(xì)胞2～3次。以5%的濃度接種羊傳染性膿皰病毒，置37℃培養(yǎng)箱吸附1 h，后加入維持液，約24 h出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)80%時收毒，于-20℃室溫反復(fù)凍融3次。

1.5 超濾膜包大小的選擇及病毒液的濃縮

超濾膜的選擇原則是超濾膜的孔徑要小于待濃縮蛋白分子直徑，一般為目標(biāo)蛋白分子直徑的1/5～1/3[4]，為減少傳染性膿皰病毒分子損失，選擇使用100 KD超濾膜。

將大量培養(yǎng)的羊傳染性膿皰病毒液用超濾膜進(jìn)行10倍濃縮。將待濃縮病毒液離心后取上清液混勻，將膜包及進(jìn)液管、出液管和濾出管安裝完畢并與蠕動泵連接完全。打開蠕動泵，速度調(diào)整為200～300 mL/min。將待測病毒液濃縮至10倍時，將進(jìn)液管從待測濃縮病毒液中取出，超濾膜包內(nèi)所有液體泵入收集杯內(nèi)時，關(guān)閉蠕動泵，收集杯內(nèi)病毒液即為濃縮完畢的10倍濃縮病毒液。

1.6 測定病毒毒力

將正常羔羊睪丸細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，加入少量胰酶清洗細(xì)胞2～3次，棄去液體后再加入胰酶溶液進(jìn)行細(xì)胞消化，待培養(yǎng)瓶底部細(xì)胞由透明變?yōu)槊Ａ訒r棄去胰酶，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，將羔羊睪丸細(xì)胞從培養(yǎng)瓶上搖下，加入少量細(xì)胞培養(yǎng)液終止胰酶反應(yīng)，用移液器多次吹打細(xì)胞懸液，將細(xì)胞團(tuán)塊吹散。將細(xì)胞懸液加入到96孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液100μL，輕輕搖晃96孔板，使細(xì)胞均勻分布于96孔板。置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。收獲的病毒原液和10倍濃縮病毒液用維持液做10倍梯度稀釋，取8個梯度各100μL加到96孔板內(nèi)，同時設(shè)定只加入維持液100μL的孔作為陰性對照，加入100μL病毒原液的孔為陽性對照。置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變，并記錄每個細(xì)胞病變孔出現(xiàn)的時間及稀釋的濃度，用Reed-Muench法計算病毒液TCID50[5]。

1.7 制備傳染性膿皰滅活疫苗

1.7.1 10倍濃縮病毒液的滅活

取濃縮后病毒液，按體積比為1∶4 000比例加入β-丙內(nèi)酯滅活，4℃作用24 h，每隔3 h顛倒搖動一次，24 h后病毒液置37℃水浴2 h脫毒。取少量已滅活的羊口瘡病毒液樣品，接種于羔羊睪丸原代細(xì)胞和Vero細(xì)胞，觀察羊睪丸原代細(xì)胞和Vero細(xì)胞是否發(fā)生病變來判斷病毒液是否滅活完全。

1.7.2 滅活病毒液的乳化及相關(guān)檢驗(yàn)

取已滅活的病毒液與法國206佐劑以1:1的比例混合，使用磁力攪拌棒以300 r/min的速度將其攪拌均勻。穩(wěn)定性檢驗(yàn)，取10 mL已乳化的疫苗加到15 mL離心管中，3 000 r/min，15 min，若無分層則可保存一年。黏度檢驗(yàn)，取內(nèi)口直徑為1.2 mm的吸管，在室溫下吸滿1 mL乳劑，垂直放出0.4 mL所需時間作為黏度單位，若流出時間為2～6 s即為合格。將已乳化好的疫苗以接種病毒的方式接種到羔羊睪丸細(xì)胞上，若無細(xì)胞病變即疫苗安全。

1.8 免疫程序

免疫試驗(yàn)羊場為常發(fā)羊傳染性膿皰羊場，未免疫羔羊在出生后15～30 d自然條件下發(fā)病率100%。

1.8.1 孕羊免疫程序

選取產(chǎn)前30 d體況良好的孕羊60只，分為A、B、C三組，每組孕羊20只，A組孕羊于產(chǎn)前28 d免疫一次，產(chǎn)前14 d免疫第二次，兩次免疫均為3 mL/只。B組孕羊于產(chǎn)前28 d免疫一次，不進(jìn)行二次免疫。C組為空白對照組，不進(jìn)行免疫。

1.8.2 羔羊免疫程序

A、B、C三組孕羊產(chǎn)出的羔羊均分為A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3九組，A1、B1、C1組羔羊分別于出生1 d和14 d注射羊傳染性膿皰滅活疫苗兩次，均為肌內(nèi)注射2 mL/只。A2、B2、C2組羔羊于出生1 d進(jìn)行一次免疫，2 mL/只。C1、C2、C3組羔羊出生后不做處理。觀察羔羊免疫后60 d內(nèi)的發(fā)病情況并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 羔羊睪丸細(xì)胞

制備的羔羊睪丸原代細(xì)胞24 h后有細(xì)胞貼壁，有明顯圓形高透光懸浮細(xì)胞，部分細(xì)胞出芽明顯。培養(yǎng)至48 h時細(xì)胞呈三角形。培養(yǎng)至72 h時細(xì)胞鋪滿T225細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面，細(xì)胞界限清晰，細(xì)胞呈條索狀，部分細(xì)胞可見明顯漩渦狀。見圖1。

圖1 正常羔羊睪丸原代細(xì)胞

2.2 細(xì)胞病變結(jié)果

羔羊睪丸原代細(xì)胞接種羊傳染性膿皰病毒24 h后細(xì)胞邊界模糊；48 h細(xì)胞核質(zhì)顏色加深，細(xì)胞折光性增強(qiáng)，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞變圓，無明顯漩渦狀；72 h時細(xì)胞大量脫落，無明顯細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞漩渦狀完全消失不見，細(xì)胞聚集似葡萄。見圖2。

圖2 接種羊傳染性膿皰病毒的羔羊睪丸細(xì)胞

2.3 TCID50結(jié)果

根據(jù)表1、表2統(tǒng)計，可計算出羊傳染性膿皰病毒液TCID50效價為106.3TCID50/0.1 mL，10倍濃縮羊傳染性膿皰病毒液TCID50效價為107.5TCID50/0.1 mL。

表1 羊傳染性膿皰病毒液TCID50測定結(jié)果

表2 10倍濃縮后的羊傳染性膿皰病毒液TCID50測定結(jié)果

2.4 制備滅活疫苗結(jié)果

2.4.1 病毒液的滅活結(jié)果

10倍濃縮羊傳染性膿皰病毒液滅活后接種羔羊睪丸細(xì)胞和Vero細(xì)胞并盲傳三代，無細(xì)胞病變產(chǎn)生，證明病毒液滅活、脫毒完全。見圖3、圖4。

圖3 滅活病毒液接種羔羊睪丸細(xì)胞

圖4 滅活病毒液接種Vero細(xì)胞

2.4.2 滅活疫苗的乳化

乳化后疫苗經(jīng)檢測均為合格。

2.5 動物免疫試驗(yàn)結(jié)果

依據(jù)免疫程序進(jìn)行滅活疫苗免疫后，對自然感染狀態(tài)下的免疫組羔羊和對照組羔羊的發(fā)病率及發(fā)病情況進(jìn)行統(tǒng)計，統(tǒng)計結(jié)果見表3。免疫組羔羊口唇部未見膿皰、痂皮等典型病變，如圖5。發(fā)病羔羊口唇部有痂皮產(chǎn)生，口腔內(nèi)有潰瘍，如圖6。試驗(yàn)結(jié)果證明本次制備的傳染性膿皰滅活疫苗在正確免疫程序下能對羔羊產(chǎn)生保護(hù)力。

表3 羔羊發(fā)病情況

圖5 免疫組未發(fā)病羔羊

圖6 未免疫組發(fā)病羔羊

3 討 論

超濾技術(shù)是以特制超濾膜質(zhì)材料為分離介質(zhì)，利用濾膜的篩分性能。以超濾膜兩側(cè)壓差作為推動力，在把提取液從濾膜高壓一側(cè)推至低壓一側(cè)過程中，將直徑大于濾膜孔徑的分子截流在高壓一側(cè)，從而克服了濾膜經(jīng)常被堵塞的問題。本實(shí)驗(yàn)中對濃縮前后病毒液TCID50的檢測可證明超濾膜濃縮對提高病毒效價效果明顯。

本實(shí)驗(yàn)中采了1∶4 000β-丙內(nèi)酯作為滅活劑進(jìn)行滅活，β-丙內(nèi)酯作為滅活劑可以直接作用于病毒核酸，而不作用于殼蛋白，不會破壞病毒的免疫原性；而且β-丙內(nèi)酯極易水解，37℃作用2 h即可水解為無毒性的代謝產(chǎn)物β-羥基丙酸[6]。

羊傳染性膿皰病流行于世界各地，主要影響綿羊和山羊，幼齡動物多因口腔病變造成的繼發(fā)感染而致嚴(yán)重死亡，對養(yǎng)羊業(yè)造成一定的損失[7]。疫苗接種免疫是預(yù)防該病的最簡便有效的解決方式。羊傳染性膿皰滅活疫苗在1975年由L‘Haridon等已經(jīng)證明了羔羊可以受血清抗體或母乳的保護(hù)。1978年C.LE JAN等人進(jìn)行了關(guān)于預(yù)防羊傳染性膿皰病時改變接種時間對哺乳期羊群初乳中免疫球蛋白有無影響的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明：在母羊懷孕期將進(jìn)行免疫，初乳中免疫球蛋白對羔羊的保護(hù)可以持續(xù)3～4周并建議在自然哺乳的狀況下進(jìn)行疫苗接種以保護(hù)羔羊[8]。2014年李娜用0.4%甲醛滅活傳染性膿皰病毒48 h后混合201佐劑和11R佐劑對2～3月齡羔羊進(jìn)行皮下注射免疫，對照組皮下注射等量生理鹽水，攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果證明201佐劑保護(hù)率67%，11R佐劑保護(hù)率50%，對照組全部發(fā)病[9]。2018年李星明采用0.4%甲醛滅活傳染性膿皰病毒后混合轉(zhuǎn)移因子鋁膠鹽佐劑對孕羊進(jìn)行頸部皮下注射可以降低孕羊傳染性膿皰病原的攜帶率，新生羔羊的病原攜帶率降低，對新生羔羊有一定的保護(hù)作用[10]。羊傳染性膿皰病毒能夠引起宿主強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，但由于病毒中一些毒力因子和免疫調(diào)節(jié)基因的存在，使該病毒能夠?qū)λ拗鬟M(jìn)行免疫調(diào)節(jié)進(jìn)而發(fā)生免疫逃避[11]。

本實(shí)驗(yàn)中制備的滅活疫苗采用了簡單安全的肌內(nèi)注射，免疫接種結(jié)果顯示對孕羊進(jìn)行肌肉注射也可對羔羊產(chǎn)生有效的保護(hù)作用。

4 結(jié) 論

采用切向流超濾膜系統(tǒng)可有效提高病毒液效價，1∶1混合206佐劑制備的羊傳染性膿皰滅活疫苗對羔羊有明顯保護(hù)作用。