蔣烈戈，彭 健，代 蓉，高 攀，蘇 政，劉 鵬，朱婷婷，鐘發(fā)鋼，趙 博，蔡國寶

（1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第九師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所（畜牧科學(xué)研究所），新疆 額敏 834601；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院 新疆 石河子 832000；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第九師165團農(nóng)業(yè)發(fā)展中心，新疆 額敏 834609）

夏洛萊肉牛原產(chǎn)于法國，是世界著名的大型肉牛品種之一。1964年中法兩國建交，法國于1965年在北京舉辦展覽會，展出原種夏洛萊肉牛，之后法國總理戴高樂贈送給周總理一批原種夏洛萊肉牛，被調(diào)入新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第九師165團進行純繁與雜交利用，以期培育出適應(yīng)新疆兵團放牧飼養(yǎng)的肉牛新品種。自夏洛萊牛落戶新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第九師，在近50年的時間里，在塔額盆地已初步形成遺傳性能穩(wěn)定、產(chǎn)肉性能好的新類群。新疆夏洛萊牛新類群個體體型略小于法國原種夏洛萊牛，群體的表型一致性較好，抗逆性強，繁殖性能高，性情溫順，適合放牧飼養(yǎng)和圈養(yǎng)舍飼，能夠充分利用塔額墾區(qū)的飼料資源[1，2]。目前兵團九師的夏洛萊群體規(guī)模近兩萬頭，已經(jīng)成為九師的特色產(chǎn)業(yè)。然而，在夏洛萊牛的雜交改良和選育過程缺乏系統(tǒng)的育種檔案資料，存在著群體遺傳背景不清、血緣關(guān)系不明等問題，影響后續(xù)新品種的選育和育種家系的建立，為解決這一難題，同時為適應(yīng)市場經(jīng)濟發(fā)展，提高新疆夏洛萊的生產(chǎn)性能，近年來，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第九師以新疆夏洛萊肉牛選育提高為肉牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重點突破方向，開展肉牛種質(zhì)資源創(chuàng)新利用，通過新疆夏洛萊良種肉牛提純復(fù)壯關(guān)鍵技術(shù)研究、九師夏洛萊肉牛遺傳結(jié)構(gòu)調(diào)查種牛選育等項目，來逐步培育出適應(yīng)性強且具有較高生產(chǎn)性能的新疆夏洛萊肉牛。

本研究利用基因組高通量檢測技術(shù)，分析九師夏洛萊雜交新類群核心群中的全基因組水平SNPs變化，結(jié)合年齡、性別等信息對新疆夏洛萊群體的遺傳多樣性進行分析，群體遺傳結(jié)構(gòu)、核心群血親關(guān)系，明確系譜信息[3]，為群體的血緣關(guān)系和遺傳背景提供科學(xué)的證明，指導(dǎo)組建核心育種群，開展全基因組選育，為新疆夏洛萊肉牛種質(zhì)資源創(chuàng)新利用打基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

樣品采自新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第九師165團5連、8連、金旭養(yǎng)殖合作社等肉?；?～9歲生產(chǎn)母牛群體，共采集測定樣本為173頭新疆夏洛萊成年牛。通過尾根靜脈采血，將采集到的血液樣本在EDTAK2采血管中保存，同時涂抹血液樣品采集卡，樣品送至北京康普森生物技術(shù)有限公司進行基因組SNP高通量檢測，獲得上述新疆夏洛萊肉牛群體的全基因組SNP原始檢測數(shù)據(jù)。

1.2 基因芯片檢測

檢測基因芯片采用NEOGEN公司GGP牛100 K芯片，是一款高密度芯片，大約由100 000個SNPs組成，平均SNP間距29.0 Kb，該芯片主要用于牛遺傳評估，全基因組關(guān)聯(lián)研究，定量性狀基因座的鑒定和比較遺傳學(xué)研究。芯片檢測試驗流程：樣本→DNA提取→DNA質(zhì)檢→擴增→片段化→聚沉、晾干→重懸→雜交→洗滌、染色→掃描芯片。

所有樣品的gDNA利用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop ND-2000(Themro Scientific)的方法進行定量分析[4]，gDNA的濃度調(diào)整至50 ng/L。然后，對所有樣品進行全基因組擴增，gDNA進行片段化、沉淀和在雜交緩沖液中重懸。將重懸的DNA片段加到芯片上，48℃孵育雜交16～24 h。雜交后，通過清洗去掉非特異性結(jié)合的DNA，剩下特異性結(jié)合的位點進行單堿基延伸，染色后利用Illumina iScan Reader進行掃描，將iScan系統(tǒng)掃描得到的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Illumina官方軟件GenomeStudioGenotyping模塊中，對原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化、聚類和基因分型，最后形成數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)質(zhì)控

分析之前，首先使用Plink（V1.90）軟件對基因型數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，只保留分型質(zhì)量最好的位點進行后續(xù)分析。根據(jù)不同的分析需要，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)有所不同，具體分析項目的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 基因型數(shù)據(jù)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

使用Plink（V1.90）和R軟件分析多態(tài)性標(biāo)記比例（Pn）、期望雜合度（He）、觀察雜合度（Ho）、IBS遺傳距離分析和近交系數(shù)（FROH），使用SNeP（V1.1）和R軟件分析群體有效含量（Ne），使用R sommer包進行G矩陣分析，使用Mega X（V10.0）和R軟件進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

由于群體有分層，將部分個體當(dāng)做離群樣本進行了剔除，剩余個體數(shù)量為173份，剩余樣品均為新疆夏洛萊群體，后繼分析以新疆夏洛萊群體為主。使用GGP10K芯片對173份牛樣本進行了基因分型，173個樣本SNP數(shù)據(jù)平均檢出率（Call Rate值）大于90%（99.40%）。

2.1 群體遺傳多樣性分析

173個新疆夏洛萊群體檢測后分析群體中有效群體含量（Ne）、群體的多態(tài)性標(biāo)記比例（Pn），群體的期望雜合度（He）和觀察雜合度（Ho）四項數(shù)據(jù)的分析，具體結(jié)果見表2。

表2 群體遺傳多樣性分析結(jié)果

有效群體含量（Ne）決定了群體平均近交系數(shù)增量的大小，反映了新疆夏洛萊群體遺傳結(jié)構(gòu)中基因的平均純合速度，是群體遺傳學(xué)研究的一個重要內(nèi)容[5，6]。此次檢測群體的有效群體含量為28.69，后期可能通過結(jié)合不同世代進行分類后分析世代間有效群體含量。群體的觀察雜合度（Ho）0.4103低于期望雜合度（He）0.4095，說明現(xiàn)有核心群體的純度較好。

基于G矩陣的基因組親緣關(guān)系分析能有效解決群體系譜不清或祖代不明對群結(jié)構(gòu)分析的影響,G矩陣分析173頭新疆夏洛萊個體間親緣關(guān)系，如圖1。

圖1 G矩陣分析173牛個體間親緣關(guān)系

在親緣關(guān)系分析結(jié)果中，可看出每一個小方格代表兩兩樣本之間的基因組親緣關(guān)系值，方格填充的顏色越接近紅色則表示該值越大，即說明兩個個體親緣關(guān)系越近；從圖1中可以看出，對角線上是每個樣本與其本身的親緣關(guān)系值，所以呈現(xiàn)紅色；親緣關(guān)系較近的個體會聚類到一起，且他們所在的單元格顏色更接近紅色。結(jié)果顯示大部分個體間的親緣關(guān)系呈中等程度，說明九師165團夏洛萊肉牛有著共同遺傳來源，這一群體在科學(xué)的人工選育條件下能夠保留一定水平的多樣性，同時也說明不同的自然環(huán)境對夏洛萊群體造成的影響是巨大的。通過親緣關(guān)系理清第九師現(xiàn)有夏洛萊肉牛的資源現(xiàn)狀和遺傳基礎(chǔ)，收集并系統(tǒng)整理它們的家系性能和親緣關(guān)系資料，建立新疆夏洛萊肉牛遺傳資料數(shù)據(jù)庫，繪制基礎(chǔ)牛群親緣關(guān)系的家系圖,可以實現(xiàn)科學(xué)引種和合理利用。數(shù)據(jù)還顯示部分個體之間的親緣關(guān)系較近，在以后的選種選配過程中要注意近交風(fēng)險。

2.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

為探明檢測新疆夏洛萊群體內(nèi)的親緣關(guān)系，使用鄰接法（Neighbor-Joining,NJ），基于IBS遺傳距離分析結(jié)果對樣本進行聚類。聚類分析結(jié)果（圖2）和親緣分析結(jié)果（圖1），將整個群體分為26個家系。新疆夏洛萊群體主成分分析結(jié)果顯示有18個樣本（見圖3）和其他所有樣本血緣關(guān)系較遠，被歸入“其他”分類中。

圖2 檢測樣本聚類分析結(jié)果

圖3 PCA群體分布圖

2.3 ROH的近交系數(shù)分析

基因組上的長純合片段（Runs of homozygosity,ROH）在所有群體中廣泛存在[7]，ROH是個體內(nèi)純合基因型的連續(xù)片段，它是由于親代將同源單倍型完整地傳遞給子代產(chǎn)生的，ROH在基因組中的大小、分布和頻率受到自然選擇、群體歷史和近交水平等諸多因素的影響。隨著高通量基因分型技術(shù)的使用，基于全基因組水平SNP信息獲得ROH分子信息能更準(zhǔn)確地估計純合性，并可以檢測過去和最近的近交情況。在173個血緣關(guān)系近的樣本中，共檢測到2 624個ROH片段，范圍在0～42個之間，70.5%的個體都含有10個以上ROH片段，個體ROH的平均長度為1 476.17 kb。通過對該群體中每個個體的ROH統(tǒng)計，得到每個個體基于ROH的近交系數(shù)值是0.030，見圖4。

圖4 基于ROH的近交系數(shù)FROH的分布

2.4 個體親緣分析

運用GGP100K芯片對173個樣本進行了基因分析，通過對分析樣本進行個體親緣關(guān)系分析，得到了可能存在親緣關(guān)系的候選個體，部分結(jié)果如表3。因為缺少個體的出生日期和性別數(shù)據(jù)，因此存在兩種親子關(guān)系，一種是其他列中的個體是第一列ID1個體的親本；另一種是其他列中的個體是第一列ID1個體的子代。匹配到2個以上個體的樣本，例如表3中999202005070224個體，分別與999202005070222和999202005070248樣本存在親緣關(guān)系，既可能是999202005070224的親本，也可能是999202005070224的子代，后續(xù)根據(jù)實際情況進行判斷。

表3 部分樣本候選個體親子關(guān)系

3 討 論

利用基因組高通量檢測技術(shù)，分析九師夏洛萊雜交新類群核心群中的全基因組水平SNPs變化，新分析新疆夏洛萊肉牛群體內(nèi)的遺傳結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系和育種背景，分析檢測結(jié)果表明，基因的平均純合速度適中，如分析該群體世代間有效群體含量，還需要做更深入的研究；173個個體間的親緣關(guān)系呈中等程度，說明九師165團夏洛萊肉牛有著共同遺傳來源，可為后期建立新疆夏洛萊肉牛遺傳資料數(shù)據(jù)庫豐富基礎(chǔ)數(shù)據(jù)提供指導(dǎo)；該群體近交系數(shù)0.030，說明該近交系數(shù)過低，這與我們在家系測定時，173頭個體達到了26個家系結(jié)果一致，說明基因的純合和穩(wěn)定結(jié)果較差，同時不易暴露有缺點的隱性基因，而對后期的育種造成一定的影響，家系數(shù)量過多，也常會出現(xiàn)多峰或偏態(tài)現(xiàn)象，不利于優(yōu)良性狀的篩選；在本研究中，測試的樣本缺少雄性個體，為明確種公牛與家系的關(guān)系，結(jié)合生產(chǎn)數(shù)據(jù)對其種用價值進行科學(xué)的評價，可補充種公牛的樣本進行核心群全面分析。

4 結(jié) 論

本次試驗利用全基因組芯片分型技術(shù)獲得全基因SNP信息進行快速、準(zhǔn)確的分析，進而獲得實驗群體新疆夏洛萊遺傳結(jié)構(gòu)、近交系數(shù)、個體親緣關(guān)系等數(shù)據(jù)，實現(xiàn)了在原肉牛群體遺傳背景不清、育種資料模糊的情況下對群體結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系和家系組成進行系統(tǒng)科學(xué)的分析，也為后續(xù)新品種的選種選配提供科學(xué)指導(dǎo)，這種方法克服了以前雜交育種時代育種時間較長，分子標(biāo)記育種時代DNA測序費用高、控制優(yōu)良性狀難度大的缺點，基因組分析運用高通量測序，通過關(guān)聯(lián)分析，對肉牛群體直接進行基因型選擇或標(biāo)記輔助選擇，從而提高選種的正確性，縮短世代間隔，同時又不受性別、時間和環(huán)境等因素的影響，具有成本低，速度快等優(yōu)點。

新疆夏洛萊肉牛經(jīng)過多年的改良和選育，其生長性能、屠宰性能和肉用性能均有不同程度的提高，今后應(yīng)積極運用現(xiàn)代育種技術(shù)，加強對本品種的保護、選育和利用，構(gòu)建地方特色肉用牛選育體系，不斷提高肉牛的生產(chǎn)水平和養(yǎng)殖效益，同時為建立現(xiàn)代新型良種繁育體系奠定堅實基礎(chǔ)。