高遠(yuǎn)，李冀，周夢丹，韓東衛(wèi)?

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001）

皮膚作為人體最大的器官是藥物經(jīng)皮吸收的主要場所，具有給藥面積大、血管分布豐富的優(yōu)勢［1-2］。但是，經(jīng)皮給藥往往難以得到有效的血藥濃度，這是由于皮膚死亡細(xì)胞構(gòu)成的角質(zhì)層具有層狀緊密結(jié)構(gòu)，極大阻礙了藥物通過皮膚，進入血液循環(huán)［3-4］。因此，降低角質(zhì)層屏障作用、改善皮膚滲透性一直是經(jīng)皮給藥研究需要攻克的難點問題。研究發(fā)現(xiàn)［5-6］，穴位部位皮膚表皮角質(zhì)層較非穴位部位更薄，結(jié)締組織更加疏松，肥大細(xì)胞分布更加豐富，這種特殊的組織結(jié)構(gòu)恰恰適合作為中藥透皮吸收的通道。

“冬病夏治”方出自《張氏醫(yī)通》，目前廣泛用于臨床，該方中白芥子、延胡索為君藥，其中白芥子味辛性溫，善走竄，是“內(nèi)病外治”常用中藥［7-8］?！侗静萁?jīng)疏性》稱白芥子：“味極辛，氣溫能搜剔內(nèi)外”，可見其辛香走竄能力之強。體外透皮實驗表明［9-12］，白芥子能夠促進組方中鹽酸麻黃堿、黃芩苷、細(xì)辛脂素等多種中藥的有效成分透皮吸收，可以視其為一種特殊的中藥透皮吸收促進劑。本文將白芥子強大的促透能力和穴位特殊的組織結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來，提出白芥子穴位用藥的治療方案，從促進穴位吸收的角度開展研究，為探索穴位用藥的作用機制提供新思路。

本研究以“冬病夏治”方中君藥白芥子和延胡索作為“藥對組合”，以延胡索有效成分——延胡索乙素為指標(biāo)，通過經(jīng)穴、非經(jīng)穴兩種途徑于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型家兔皮膚給藥，考察有、無白芥子配伍以及經(jīng)穴、非經(jīng)穴這兩種途徑下，白芥子對延胡索乙素皮膚滲透的促進作用，旨在尋找到一種具有更優(yōu)皮膚滲透性的外用給藥方案。

1 材料

1.1 動物

新西蘭家兔48只，雌雄各半，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證：SCX黑2022005，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25 ℃、濕度（45 ±5）%、12 h光照，飼養(yǎng)1周后進行造模，取材前禁食24 h。

1.2 儀器

Franz透皮擴散儀（天津市正通科技有限公司）；高效液相色譜儀（Waters 中國），配置QSM－FIN－TUV色譜工作站。

1.3 試藥

白芥子購自北京同仁堂股份有限公司，自制為白芥子粉，現(xiàn)用現(xiàn)粉碎；延胡索乙素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111902－202203）；甲醇為色譜醇（美國Dikma公司）；弗式完全佐劑（F5881－10 mL，美國Sigma公司）；卵蛋白（A5253，美國Sigma公司）。

2 方法

2.1 模型建立與分組

家兔背部取5個點，每個點皮下注射0.2 mL弗氏完全佐劑，作為首次致敏；第14天相同位置再次注射弗氏完全佐劑，加強致敏；第2次致敏第6天，雙膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射卵蛋白0.4 mL（濃度為10.0 mg/mL），作為誘發(fā)劑；3 d后膝關(guān)節(jié)腫脹達到最高峰，完成建模。

比較加入白芥子、不加白芥子體外釋放分組：將模型家兔隨機分為空白組（不加白芥子）、非經(jīng)穴白芥子低劑量組（“冬病夏治”處方0.5倍量）、非經(jīng)穴白芥子中劑量組（“冬病夏治”處方量）和非經(jīng)穴白芥子高劑量組（“冬病夏治”處方2倍量）。

比較經(jīng)穴、非經(jīng)穴途徑體外釋放分組：將模型家兔隨機分為非經(jīng)穴組（“冬病夏治”處方量）、“足三里”白芥子低劑量組（0.5倍處方量白芥子）、“足三里”白芥子中劑量組（處方量白芥子）和“足三里”白芥子高劑量組（2倍處方量白芥子）。

2.2 延胡索乙素分析方法的建立

2.2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS（2.1 mm × 75 mm，1.8 μm）；流動相：甲醇－0.1%甲酸水（62∶38三乙醇胺調(diào)節(jié)至pH值為6）；流速：0.3 mL/min；檢測波長：280 nm；進樣體積：2 μL；柱溫：30 ℃。

2.2.2 對照品溶液制備

精密稱取延胡索乙素對照2.5 mg，置于25 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻后得到0.1 mg/mL對照品儲存液，4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 樣品溶液的制備

樣品液過0.22 μm微孔濾膜，-20 ℃冰箱保存。精密取擴散池續(xù)濾液，按“2.2.1”項下色譜條件進行UPLC檢測。

2.2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.2”項下儲備液，乙醇定容，制備成0.001、0.002、0.004、0.01、0.02、0.1 mg/mL系列對照品溶液，在“2.2.1”項下色譜條件進行檢測，以藥物峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.5 專屬性試驗

按“2.2.2”項下方法制備空白溶液，甲醇定容，微孔濾膜過濾，按“2.2.1”項下色譜條件進行UPLC檢測。

2.2.6 精密度試驗

精密稱取0.001、0.004、0.1 mg/mL對照品溶液，平行進樣6次，按“2.2.1”項下色譜條件進行UPLC檢測。

2.2.7 加樣回收率試驗

精密稱取“2.2.2”項下延胡索乙素對照品溶液，加入不含藥的透皮接收液，5 mL容量瓶定容，配制成0.001、0.004、0.1 mg/mL溶液，每個質(zhì)量濃度3份。

2.3 體外透皮實驗

2.3.1 穴位定位

穴位部位選取家兔膝關(guān)節(jié)“足三里”穴位（位于后肢外側(cè)，脛骨粗隆下約0.3 cm處）。非經(jīng)穴部位選擇脛骨邊緣外側(cè)，足三里旁開1～2 cm處（注意避開經(jīng)絡(luò)線）。

2.3.2 離體皮膚處理

剪掉模型家兔膝關(guān)節(jié)部位較長的兔毛，脫毛膏除去絨毛，再將家兔處死。按照“2.3.1”項下定位取“足三里”穴位處、足三里旁開處（非穴位區(qū)），得到面積約1.5 cm2的圓形皮膚，刀片刮掉皮下脂肪組織，生理鹽水清洗后，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3 離體透皮試驗

將處理好的皮膚固定于Franz透皮擴散儀，設(shè)置恒溫水浴溫度36.8 ℃，磁力攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min。接收室內(nèi)放入轉(zhuǎn)子，注入5 mL生理鹽水（使用前超聲脫氣）。平衡實驗條件0.5 h之后，按照“2.1”項下分別將白芥子－延胡索乙素糊狀物均勻涂于離體皮膚，置于擴散室和接收室之間，保持角質(zhì)層一側(cè)向上，接口面積為0.636 cm2，接收室體積5 mL。于0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12 h分別取樣1.0 mL，同時補充相同體積的生理鹽水。按照“2.2.1”項下色譜條件測定延胡索乙素含量，利用累計釋放公式計算單位面積累積透過量和百分比。

其中，Q（mg/cm2）為累積透過量，Cn和Ci分別代表為第n時間點、i個取樣點測得的質(zhì)量濃度（mg/mL），A為滲透面積（cm2），M為理論含藥量。

穩(wěn)態(tài)滲透速率為Q/h，該時間為累積透過量－時間曲線圖的直線部分的斜率，本實驗平均5～6 h區(qū)間內(nèi)。以累積滲透率（Q%）為縱坐標(biāo)，以時間（t）為橫坐標(biāo)得到透皮吸收曲線；進行線性回歸，得到體外滲透參數(shù)和釋放曲線。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行分析，多組間采用單因素方差分析，配對t檢驗兩組間差異（置信區(qū)間95%），相關(guān)系數(shù)顯示該條件下適合進行配對t檢驗比較顯著性。P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 模型建立與分組結(jié)果

按照“2.1”項下方法造模，3 d后關(guān)節(jié)腫脹度為正常狀態(tài)下2倍左右，且出現(xiàn)體溫上升，飲食下降、活動減少的狀態(tài)，表明造模成功。

3.2 延胡索乙素分析結(jié)果

按照“2.2”項下方法，建立分析方法，回歸方程為Y= 9 567.4X－5 422.4（R= 0.999 87）。色譜峰型良好，出峰位置無干擾，專屬性良好；精密度試驗測得RSD分別為1.97%、1.52%、0.99%，表明儀器精密度良好；加樣回收率試驗測得平均加樣回收率為98.49%，RSD為1.22%。

3.3 體外透皮實驗結(jié)果

白芥子配伍下，累積透過量、穩(wěn)態(tài)滲透速率均優(yōu)于缺少白芥子的組別。隨著白芥子用量增加，累積透過量、穩(wěn)態(tài)滲透速率均有提高，且高劑量組 ＞ 中劑量組 ＞ 低劑量組。見表1?！白闳铩苯?jīng)穴給藥的條件下累積透過量、穩(wěn)態(tài)滲透速率均優(yōu)于非經(jīng)穴給藥。隨著白芥子用量增加，累積透過量、穩(wěn)態(tài)滲透速率均有提高，且高劑量組 ＞ 中劑量組 ＞ 低劑量組。見表2。白芥子配伍的條件下，12 h內(nèi)累積滲透率顯著優(yōu)于缺少白芥子的組別。隨著白芥子用量增加，累積滲透率顯著提高。見圖1。“足三里”經(jīng)穴給藥的條件，12 h內(nèi)累積滲透率顯著優(yōu)于非經(jīng)穴給藥。隨著白芥子用量增加，累積滲透率顯著提高。見圖2。

圖1 白芥子促延胡索乙素累積滲透率曲線圖

圖2 白芥子促延胡索乙素經(jīng)穴、非經(jīng)穴累積滲透率曲線圖

表1 各組延胡索體乙素體外滲透參數(shù)表（ ± s，n = 6）

表1 各組延胡索體乙素體外滲透參數(shù)表（ ± s，n = 6）

組別空白組（不加白芥子）非經(jīng)穴白芥子低劑量組非經(jīng)穴白芥子中劑量組非經(jīng)穴白芥子高劑量組回歸方程Y = 0.022 2X + 0.004 7 Y = 0.029 1X + 0.036 8 Y = 0.040 7X + 0.048 2 Y = 0.052 8X + 0.054 6穩(wěn)態(tài)滲透速率［mg/（cm2·h）］0.320 0.467 0.643 0.782相關(guān)系數(shù)R2 = 0.990 6 R2 = 0.968 5 R2 = 0.951 7 R2 = 0.962 6累積透過量（mg/cm2）2.02 ± 0.30 2.96 ± 0.31 3.70 ± 0.35 4.94 ± 0.40

表2 各組延胡索乙素經(jīng)穴、非經(jīng)穴體外滲透參數(shù)表（ ± s，n = 6）

表2 各組延胡索乙素經(jīng)穴、非經(jīng)穴體外滲透參數(shù)表（ ± s，n = 6）

組別非經(jīng)穴組“足三里”白芥子低劑量組“足三里”白芥子中劑量組“足三里”白芥子高劑量組回歸方程Y = 0.040 7X + 0.048 2 Y = 0.051 5X + 0.080 2 Y = 0.064 4X + 0.112 1 Y = 0.078 3X + 0.103 1相關(guān)系數(shù)R2 = 0.951 7 R2 = 0.943 7 R2 = 0.921 7 R2 = 0.933 4累積透過量（mg/cm2）3.70 ± 0.35 5.01 ± 0.37 6.20 ± 0.41 7.49 ± 0.49穩(wěn)態(tài)滲透速率［mg/（cm2·h）］0.643 0.905 1.128 1.435

3.4 統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果

白芥子高、中、低三組累積透過量均顯著高于不加白芥子的空白組（P＜ 0.01），促滲透倍數(shù)隨白芥子劑量提高而增加，即高劑量組 ＞ 中劑量組 ＞ 低劑量組。見表3。經(jīng)穴給藥的白芥子高、中、低三組累積透過量均顯著高于非經(jīng)穴組（P＜ 0.01），促滲透倍數(shù)隨白芥子劑量提高而增加，即高劑量組 ＞ 中劑量組 ＞ 低劑量組，表現(xiàn)出滲透性對白芥子用量的依賴性。見表4。

表3 白芥子促延胡索乙素滲透配對t檢驗

表4 白芥子促延胡索乙素滲透經(jīng)穴、非經(jīng)穴配對t檢驗

4 討論

一直以來，透皮吸收量少、血藥濃度低、累積釋放量達不到有效濃度是制約中藥經(jīng)皮制劑發(fā)展的難題。因此，無論是制備微乳、柔性脂質(zhì)體等被動促進滲透方法，還是微針和離子導(dǎo)入，其最終目的都是降低角質(zhì)層屏障作用，提高藥物進入血液循環(huán)的量。而人體穴位部位恰恰具有角質(zhì)層較薄、循經(jīng)低電阻的特點，是藥物經(jīng)皮滲透的特殊通道。本文中非經(jīng)穴（處方量）組與空白組給藥方式、劑量是相同的，但不在同一批次，分別作為給藥部位、給藥劑量研究的對照，因此文中分為兩組。

?？傮J等［13］在100名受試者的經(jīng)絡(luò)上進行皮膚阻抗測試，發(fā)現(xiàn)經(jīng)絡(luò)上所有穴位均有角質(zhì)層薄、低電阻的特性。這是因為在穴位部位，由死亡細(xì)胞組成的角質(zhì)層更薄，導(dǎo)電性更強，具有低電阻特性。安賀軍［14］利用體表電阻檢測法對穴位處電阻進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同穴位間存電阻在差異，但是均低于非穴位部位，其中“足三里”和非穴位平均阻抗分別為（11.61 ± 2.09）（19.83 ± 2.39） Ω/m2，明顯存在差異，可見二者角質(zhì)層厚度差異顯著。本文發(fā)現(xiàn)延胡索乙素“足三里”累積釋放量顯著高于非經(jīng)穴，與上述研究結(jié)論一致，表明穴位作為給藥部位更有利于有效成分透皮吸收。

以往透皮滲透研究中，往往將中藥方劑中的單味藥作為研究重點，忽視了藥物配伍的相互作用。越來越多的研究［15-17］表明，古代經(jīng)驗方中的一些藥物不但有藥理作用，同時能夠起到透皮吸收促進劑的作用，能夠促進方中其他藥物透皮吸收，特別是具有大量揮發(fā)性成分的中藥，其促進透皮效果尤為顯著，起到藥物和輔料（透皮促進劑）的“雙重”作用，實現(xiàn)了“藥輔合一”。本文將“冬病夏治”方中君藥白芥子、延胡索組成“藥對”，發(fā)現(xiàn)胡索乙素累積透過量、穩(wěn)態(tài)滲透速率、累積滲透率3種滲透參數(shù)均隨著白芥子用量提高而增加，具有劑量依賴性，結(jié)合穴位給藥和白芥子透皮促進的“雙重”作用，得到了一種更好的中藥外用給藥方案。穴位部位的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生物物理特性具有明顯特異性［18-20］，中藥的經(jīng)穴吸收過程與非經(jīng)穴吸收也必然存在差異。但是，藥物透皮吸收后，在體內(nèi)分布、轉(zhuǎn)運、排泄的路徑是否也存在特異性，藥物與穴位間是否有相互作用，還需進一步研究。