魯小紅 黃麗瓊 賀 藝 瞿小祥 （咸寧市中心醫(yī)院產(chǎn)科，咸寧437100）

子癇前期（pre-eclampsia，PE）是一種妊娠特異性的、免疫介導的綜合征，其特征是高血壓發(fā)作，并在妊娠20周后常常伴有尿蛋白增加［1］。免疫在PE發(fā)生中起到關鍵作用，研究顯示蛻膜中的免疫細胞主要由蛻膜自然殺傷細胞和T細胞（約10%）等組成，研究顯示Th17細胞水平的升高和Treg水平的降低會影響滋養(yǎng)層細胞侵襲和血管生成［2-3］。免疫細胞的分化受到哺乳動物雷帕霉素受體（mammalian target of rapamycin，mTOR）的調控，mTOR可通過調節(jié)缺 氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α） 的表達調節(jié)免疫細胞的分化［4］。mTOR/HIF-1α可以通過調節(jié)滋養(yǎng)細胞侵襲和遷移參與PE的發(fā)生，但是該通路是否可通過調節(jié)免疫水平參與PE尚不明確。最新有研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以治療妊娠糖尿病，并且具有預防PE的作用，但是其機制仍不清楚［5-6］。本文主要基于mTOR/HIF-1α途徑探討二甲雙胍對PE的影響以及對免疫水平的影響，為臨床更好地治療PE提供基礎實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級SD大鼠（雌性和雄性，240～260 g，8～12周，南京醫(yī)科大學動物中心，中國）；L-硝基精氨酸甲酯（Q110297，上海雅吉生物，中國）；無創(chuàng)血壓檢測系統(tǒng)（Kent Scientific公司，美國）；二脲試劑（HPBIO-R1253，鵬派生物技術公司，中國）；生化試劑盒（Neyotime公司，中國）；標準Ficoll Hypaque梯度離心試劑（Axis Shield公司，英國）；蛋白質轉運抑制劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，美國）；CD4+、CD25、FOXP3和IL-17抗體以及BD Aria IIY熒光活細胞分選儀（BD公司，美國）；RNAspin Mini試劑盒（GE Healthcare，美國）；Bestar qPCR RT和BestarTMqPCR試劑盒（DBI Bioscience公司，德國）；Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統(tǒng)（Santa公司，美國）；免疫組化染色IL-17抗體、FOXP3抗體和二抗（ab168194，ab75763）、一抗和山羊抗兔HRP-IgG二抗（ab205718，Abcam公司，美國）；PVDF膜（JS0344，JSENB公司，中國香港）；ECL顯色試劑盒（Thermo Fisher公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、建模和干預 使大鼠適應環(huán)境 1周，并置于25～26 ℃通風良好的籠中，相對濕度為50%～70%，定期進行紫外線消毒，在6：00 至18：00 進行光照，并自由攝入食物和水。將大鼠交配（雌性∶雄性2∶1），并在第2天早晨收集陰道涂片置于顯微鏡下觀察。在涂片上觀察到精子存在的日期為妊娠第0天。在妊娠第5天至第10天，將總共45只妊娠大鼠隨機分為對照組、PE組和PE+二甲雙胍組（n=15）。從妊娠第10天開始，PE組和PE+二甲雙胍組大鼠連續(xù)皮下注射劑量為250 mg/（kg·d）的L-硝基精氨酸甲酯構建PE模型，連續(xù)7 d［7］。對照組大鼠注射等體積的生理鹽水。PE+二甲雙胍組大鼠在妊娠第10 天通過二甲雙胍灌胃，劑量為200 mg/（kg·d），連續(xù)7 d。

1.2.2 觀察指標及方法

1.2.2.1 血壓檢測 在妊娠的第9天和第18天，通過尾氣袖帶法使用無創(chuàng)血壓檢測系統(tǒng)測量大鼠的收縮壓。血壓測量在上午8：00進行，在測量前將大鼠禁食2 h，在測量前測量器置于預熱的恒溫器（37 ℃）中10 min。隨后，在測量過程中，將室溫保持在25 ℃。使用預調節(jié)的尾袖裝置在大鼠心律穩(wěn)定時將夾子置于大鼠尾巴的根部，以測量大鼠的血壓。測量每只大鼠的血壓3次，取其平均值。

1.2.2.2 24 h尿蛋白 在妊娠第9天和第18天從每組大鼠中收集尿液，在717 g和4 ℃下將尿液離心10 min去除沉淀物。將縮二脲試劑添加到尿液樣本中以檢測24 h尿蛋白。

1.2.2.3 免疫組化染色檢測蛻膜組織中免疫細胞浸潤 通過免疫組化染色檢測子宮蛻膜組織中Th17細胞標志蛋白IL-17評估Th17細胞浸潤情況［8］，通過檢測Treg細胞標志蛋白叉頭樣轉錄因子 （FOXP3）評估Treg細胞浸潤情況。將蛻膜組織用4%的聚甲醛固定并用梯度乙醇脫水，包埋在石蠟中，制成厚度為5 μm的組織玻片標本，將切片置于-20 ℃的冷丙酮中固定15 min。然后在37 ℃下分別與抗大鼠IL-17和FOXP3抗體孵育1 h，然后加入二抗進行顯色，最后利用蘇木精復染細胞核，棕色和黃色染色代表陽性細胞。隨機選擇5個高倍視野，Th17細胞和Treg細胞比例（%）=IL-17或FOXP3陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2.2.4 流式細胞術檢測Th17和Treg細胞比例 大鼠處死前抽取尾靜脈血液，通過標準Ficoll Hypaque梯度離心試劑分離外周血單個核細胞。將所得的單個核細胞用磷酸鹽緩沖液以500 μg/g洗滌兩次，每次持續(xù)5 min。通過磁激活細胞分選試劑從外周血單個核細胞中分離出CD4+T細胞。為了分析Treg細胞，單個核細胞通過與大鼠抗CD25（5 μg/ml）和抗大鼠FOXP3（5 μg/ml）在黑暗中孵育20 min進行表面標記染色。為了分析Th17細胞，在24孔板中用含有蛋白質轉運抑制劑的細胞刺激混合物孵育4 h。然后將細胞收獲至5 μl的無菌試管中，洗滌后加入大鼠抗CD4（5 μg/ml）和抗大鼠IL-17（5 μg/ml）在黑暗中孵育20 min進行表面標記染色。使用BD Aria Ⅱ活細胞分選儀對細胞進行分析。

1.2.2.5 RT-qPCR 使用RNAspin Mini試劑盒從收集到的CD4+T細胞中提取RNA，然后使用Bestar qPCR RT試劑盒將其逆轉錄為cDNA，條件如下：37 ℃ /15 min；98 ℃ /5 min。使用BestarTMqPCR預混液進行qPCR實驗，條件如下：95 ℃/2 min， 94 ℃/20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃/20 s，40個循環(huán)，最后在72 ℃下延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統(tǒng)進行RT-qPCR分析。mTOR正向引物：5'-ATGACGAGACCCAGGCTAAG-3'，反 向 引 物：5'-GCCAGTCCATGCCATCAG-3'；HIF-1α正 向 引 物：5'- GTTTACTAAAGGACAAGTCACC-3'，反向引物：5'- TTCTGTTTGTTGAAGGGAG-3'；GAPDH正向引物：5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3'，反向引物：5'- CAAAGTTGTCATGGATGHACC-3'。GAPDH作為內源參照，通過比較循環(huán)閾值評估m(xù)RNA水平。

1.2.2.6 Western blot 將CD4+T細胞裂解后提取總蛋白并檢測濃度。然后分別取總量為40 μg的總蛋白進行分離，分離條件為10%的聚丙烯酰胺凝膠、80～120 V、90 min。濕法轉膜，在100 mV下將分離的蛋白轉移到PVDF膜上。將一抗稀釋500倍后分別加入膜中并在4 ℃下孵育過夜。洗滌后加入山羊抗兔HRP-IgG二抗室溫孵育1 h。本研究內參為GAPDH，分析目標蛋白條帶相對于GAPDH的灰度值分析蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)以±s表示。統(tǒng)計分析使用SPSS19.0軟件。組間比較分別使用方差檢驗和SNK-q檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 二甲雙胍對PE大鼠收縮壓的影響 妊娠第 9天三組小鼠血壓均正常（P＞0.05）。在妊娠第18天三組的血壓比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。PE組的收縮壓（148.23±11.96） mmHg和舒張壓（104.42±9.67） mmHg均顯著高于對照組（P＜0.05），PE+二甲雙胍組的收縮壓（128.74±10.35） mmHg和舒張壓（91.28±8.61） mmHg均顯著低于PE組（P＜0.05），見表1。

表1 二甲雙胍對PE大鼠血壓的影響（±s，n=15，mmHg）Tab.1 Effect of metformin on blood pressure of PE rats （±s，n=15，mmHg）

表1 二甲雙胍對PE大鼠血壓的影響（±s，n=15，mmHg）Tab.1 Effect of metformin on blood pressure of PE rats （±s，n=15，mmHg）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs PE group.

2.2 二甲雙胍對PE大鼠24 h尿蛋白的影響 在妊娠第9天各組大鼠24 h尿蛋白均為0.09 g左右，處于正常范圍。在妊娠第18天三組的24 h尿蛋白比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。PE組的24 h尿蛋白0.145±0.013 g顯著高于對照組（P＜0.05），PE+二甲雙胍組的24 h尿蛋白（0.118±0.011 g顯著低于PE組（P＜0.05），見表2。

表2 二甲雙胍對PE大鼠24 h尿蛋白的影響（±s，n=15， g/24 h）Tab.2 Effect of metformin on 24 h urine protein in PE rats（±s，n=15，g/24 h）

表2 二甲雙胍對PE大鼠24 h尿蛋白的影響（±s，n=15， g/24 h）Tab.2 Effect of metformin on 24 h urine protein in PE rats（±s，n=15，g/24 h）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs PE group.

2.3 二甲雙胍對PE大鼠胎盤蛻膜組織中Th17和Treg細胞浸潤的影響 如圖1所示，藍色為染色的細胞核，棕色為IL-17或FOXP3陽性細胞。結果顯示，三組PE大鼠胎盤蛻膜組織中Th17和Treg細胞浸潤情況比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。PE組的Th17細胞比例（14.36±1.53）%和Th17/Treg比值（13.81±1.21）顯著高于對照組，Treg比例（1.04±0.12）%顯著低于對照組（P＜0.05）。PE+二甲雙胍組 的Th17細 胞 比例（9.83±1.06）%和Th17/Treg（4.31±0.45）顯 著 低 于PE組，Treg比 例（2.28±0.31）%顯著高于PE組（P＜0.05）。見表3。

表3 二甲雙胍對PE大鼠胎盤蛻膜組織中Th17和Treg細胞浸潤的影響（±s，n=15）Tab.3 Effect of metformin on Th17 and Treg cell infiltration in placenta and decidua of PE rats （±s，n=15）

表3 二甲雙胍對PE大鼠胎盤蛻膜組織中Th17和Treg細胞浸潤的影響（±s，n=15）Tab.3 Effect of metformin on Th17 and Treg cell infiltration in placenta and decidua of PE rats （±s，n=15）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs PE group.

圖1 免疫組化染色檢測二甲雙胍對PE大鼠胎盤蛻膜組織中Treg細胞和Th17細胞浸潤的影響（×200）Fig.1 Immunohistochemical staining to detect effect of metformin on infiltration of Treg cells and Th17 cells in placenta and decidua of PE rats （×200）

2.4 二甲雙胍對PE大鼠Th17和Treg細胞分化的影響 如圖2所示，CD4+IL17+為Th17細胞。CD25+FOXP3+為Treg細胞。三組大鼠外周血中Th17和Treg細胞比例比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。PE組的Th17細胞比例（1.94±0.21）%和Th17/Treg（0.64±0.07）顯著高于對照組，Treg比例（3.02±0.36）%顯著低于對照組（P＜0.05）。PE+二甲雙胍組的Th17細胞比例（1.53±0.16）%和Th17/Treg（0.36±0.04）顯著低于PE組，Treg比例（4.21±0.51）%顯著高于PE組（P＜0.05）。見表4。

表4 二甲雙胍對PE大鼠Th17和Treg細胞分化的影響 （±s，n=15）Tab.4 Effect of metformin ondifferentiation of Th17 and Treg cells in PE rats （±s，n=15）

表4 二甲雙胍對PE大鼠Th17和Treg細胞分化的影響 （±s，n=15）Tab.4 Effect of metformin ondifferentiation of Th17 and Treg cells in PE rats （±s，n=15）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs PE group.

圖2 流式細胞術檢測二甲雙胍對PE大鼠Th17細胞分化的影響Fig.2 Flow cytometry detection of effect of metformin on differentiation of Th17 cells in PE rats

2.5 二甲雙胍對PE大鼠mTOR和HIF-1α mRNA表達水平的影響 三組的mTOR/HIF-1α 通路中基因轉錄水平比較差具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。PE組的mTOR和HIF-1α mRNA顯著高于對照組（P＜0.05），PE+二甲雙胍組的mTOR和HIF-1α mRNA水平顯著低于PE組（P＜0.05），見表5。

表5 二甲雙胍對PE大鼠mTOR和HIF-1α mRNA表達水平的影響（±s，n=15）Tab.5 Effect of metformin on expression levels of mTOR and HIF-1α mRNA in PE rats （±s，n=15）

表5 二甲雙胍對PE大鼠mTOR和HIF-1α mRNA表達水平的影響（±s，n=15）Tab.5 Effect of metformin on expression levels of mTOR and HIF-1α mRNA in PE rats （±s，n=15）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs PE group.

2.6 二甲雙胍對PE大鼠mTOR/HIF-1α通路中蛋白表達水平的影響 三組的mTOR/HIF-1α通路中蛋白表達水平比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。PE組的mTOR和HIF-1α蛋白水平顯著高于對照組（P＜0.05），PE+二甲雙胍組的mTOR和HIF-1α蛋白水平顯著低于PE組（P＜0.05），見圖3、表6。

圖3 Western blot檢測二甲雙胍對PE大鼠mTOR和HIF-1α蛋白表達水平的影響Fig.3 Western blot detection of effect of metformin on expression of mTOR and HIF-1α protein in PE rats

表6 二甲雙胍對PE大鼠mTOR和HIF-1α蛋白表達水平的影響（±s，n=15）Tab.6 Effect of metformin on expression level of mTOR and HIF-1α protein in PE rats （±s，n=15）

表6 二甲雙胍對PE大鼠mTOR和HIF-1α蛋白表達水平的影響（±s，n=15）Tab.6 Effect of metformin on expression level of mTOR and HIF-1α protein in PE rats （±s，n=15）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs PE group.

3 討論

PE是孕產(chǎn)婦病死和發(fā)病的主要原因，給醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來了沉重負擔。據(jù)估計，全球PE的患病率約為所有妊娠婦女的5%～8%，在發(fā)展中國家可能更高［9］。PE是孕產(chǎn)婦和產(chǎn)前病死和發(fā)病的主要原因，并且目前臨床上缺乏有效的治療方法。二甲雙胍是雙胍類抗糖尿病，可防止肝臟糖異生并增加外周組織對胰島素的敏感性［10］。近年來研究顯示二甲雙胍在產(chǎn)科中廣泛應用。研究證明二甲雙胍可有效治療妊娠糖尿病，并可能預防PE［11］。但是二甲雙胍對PE發(fā)展的影響隨機試驗尚待進行。

蛻膜中的免疫細胞主要由蛻膜自然殺傷細胞、Th17、Treg、巨噬細胞等組成。這些細胞分泌的各種免疫細胞和細胞因子參與調節(jié)滋養(yǎng)細胞的侵襲、血管生成和螺旋動脈重塑并誘導免疫耐受［12-13］。但是二甲雙胍是否可以調節(jié)PE免疫仍不清楚。本研究結果提示二甲雙胍可以顯著抑制PE大鼠的血壓，降低尿蛋白水平。此外，PE模型大鼠胎盤蛻膜組織中Th17細胞比例升高而Treg細胞比例明顯降低，二甲雙胍可以調節(jié)Th17/Treg平衡。Th17細胞會分泌促炎因子從而誘發(fā)免疫炎癥反應導致血壓升高和影響胎盤植入，Treg細胞會拮抗Th17功能，并起到免疫抑制作用，參與免疫耐受［14-15］。妊娠高血壓是PE的重要誘因，一項薈萃分析結果顯示二甲雙胍可以有效抑制血壓升高，并對PE具有緩解作用［16］。研究顯示二甲雙胍可能通過抑制Th17誘導的炎癥反應改善自噬和線粒體功能，從而緩解糖尿病相關炎癥［17］。二甲雙胍也可以通過調節(jié)Treg細胞減少脾臟生發(fā)中心的形成來減輕博來霉素誘導的硬皮?。?8］。LEE等［19］研究結果顯示二甲雙胍可抑制T細胞增殖并抑制Th1和Th17細胞分化，并可劑量依賴性方式促進Treg的水平，從而緩解自身免疫性胰島炎。這提示二甲雙胍可能通過提高胎盤組織中Treg細胞水平，減少Th17細胞浸潤，從而恢復母體對胎盤的免疫耐受，緩解PE。

為進一步分析二甲雙胍緩解PE以及免疫細胞浸潤的機制，實驗檢測了外周血中Th17和Treg的水平，以及CD4+細胞中mTOR/HIF-1α通路的表達水平。胎盤組織中的免疫細胞浸潤來源于外周血，而外周血的T細胞分化受到mTOR/HIF-1α通路的調控，研究提示mTOR會激活HIF-1α的轉錄活性，進而調控基因轉錄水平誘導T細胞向Th17細胞分化，并減少Treg細胞的生成［20-21］。本次研究結果顯示二甲雙胍可使PE大鼠外周血中Th17/Treg平衡向Treg移動，并抑制T淋巴細胞中mTOR和HIF-1α的轉錄和翻譯水平。研究顯示二甲雙胍可以通過抑制mTOR/HIF-1α途徑抑制口腔鱗狀細胞癌的增殖和運動能力［22］。二甲雙胍也可以通過抑制mTOR/HIF-1α 通路水平調節(jié)肝細胞癌患者異常的代謝功能［23］。AL-HASHEM等［24］的研究結果表明二甲雙胍可通過抑制mTOR/HIF-1α軸緩解硫代乙酰胺誘導的肝組織纖維化和炎癥。這提示二甲雙胍可能通過抑制mTOR/HIF-1α通路減少T細胞向Th17細胞分化并促進Treg細胞分化，從而改善胎盤組織浸潤的Th17/Treg平衡，恢復母體和胎兒正常的免疫水平，從而緩解PE。

綜上所述，二甲雙胍可能通過抑制mTOR/HIF-1α通路緩解調控外周血和胎盤組織中Th17/Treg平衡，恢復免疫耐受水平，從而緩解PE。關于二甲雙胍對PE的治療作用、安全性和對胎兒的影響仍需要臨床試驗研究，并且其調控mTOR/HIF-1α通路的分子機制也需要進一步研究。