廖曉瑩 吳 迪 吳明江 高藝恬 （溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，溫州 325000）

膿毒血癥是一種高度異質(zhì)性疾病，第三次膿毒血癥國際共識定義（Sepsis 3.0）將膿毒血癥定義為感染引起宿主反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的器官功能障礙，嚴(yán)重危害人類生命健康［1］。膿毒血癥的高發(fā)病率和高病死率給全球健康問題帶來了巨大威脅。全世界預(yù)計每年會出現(xiàn)4 890萬例膿毒血癥患者，其中1 100萬人死亡，尤其是一些中低收入國家［2］。膿毒血癥治療后第1年，即使已出院的膿毒血癥患者也會患有各種各樣的長期后遺癥且具有較高病死率，進一步表明了膿毒血癥給醫(yī)療和社會帶來的重大負(fù)擔(dān)［3］。

膿毒血癥是病原體入侵宿主引起的感染，膿毒血癥住院患者免疫系統(tǒng)中存在“炎癥風(fēng)暴”和免疫抑制跡象，其程度因人而異［4］。免疫抑制會減弱機體對病原體或其他致病源的敏感性，進一步破壞宿主免疫系統(tǒng)并使機體偏離穩(wěn)態(tài)。雖然許多膿毒血癥患者在重癥監(jiān)護病房中接受治療后得以存活，但由于免疫抑制，又發(fā)展為新的慢性危重疾?。?］。目前，抗膿毒血癥藥物研究多集中于研究膿毒血癥患者初期炎癥反應(yīng)，多個抗膿毒血癥相關(guān)藥物臨床試驗反復(fù)失敗，F(xiàn)DA也尚未批準(zhǔn)用于治療膿毒血癥的藥物。因此，在消除病原體引起的過度炎癥反應(yīng)同時，也能控制隨之而來的免疫抑制反應(yīng)可能是膿毒血癥治療藥物開發(fā)的有效策略。

1 膿毒血癥發(fā)病機制

1.1 膿毒血癥期間持續(xù)性過度炎癥反應(yīng) 膿毒血癥早期死亡通常表現(xiàn)為心血管衰竭和多種器官功能障礙，主要由過度炎癥反應(yīng)所致，因此早期抑制過度炎癥反應(yīng)是治療膿毒血癥有力的策略。機體過度炎癥反應(yīng)是由先天免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的，宿主先天免疫系統(tǒng)通過先天免疫細胞（如樹突狀細胞、巨噬細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞和上皮細胞）的各種模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）識別病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），從而“感知”病原體，與此同時宿主也會釋放損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）參與宿主免疫應(yīng)激。通過識別PAMPs和DAMPs，先天免疫系統(tǒng)會清除病原性微生物從而保護機體，如果無法消除入侵病原體并導(dǎo)致其在體內(nèi)大量繁殖，宿主可能發(fā)生持續(xù)性炎癥激活甚至引發(fā)器官功能障礙［6］。膿毒血癥發(fā)生與這種先天免疫系統(tǒng)強激活有關(guān)。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌外膜主要成分，自然界已知最有效的免疫刺激性化合物之一，過度激活先天免疫系統(tǒng)而作為膿毒血癥的關(guān)鍵致病成分。最常見的PAMP激活即為LPS途徑，LPS可結(jié)合位于細胞表面的Toll樣受體（Tolllike receptor，TLR）等PRR被免疫系統(tǒng)識別［7］。白細胞分化抗原14（CD14）可通過糖基磷脂酰肌醇錨定于單核細胞、巨噬細胞及多形核白細胞表面，也有部分以游離形式存在于血液，這兩種形式均能參與應(yīng)對LPS血清依賴的細胞反應(yīng)。CD14通過將LPS遞呈給髓樣分化蛋白-2（myeloid differential protein-2，MD-2）促使其與TLR4形成復(fù)合四聚體，進而激活膜內(nèi)Toll/IL-1受體（TIR）招募其關(guān)鍵接頭分子-髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88），從而觸發(fā)促炎細胞因子釋放和IFNs-Ⅰ產(chǎn)生［8］。因此，阻斷或消除這些細胞因子可為急性感染模型動物提供保護作用［9］。盡管這些實驗結(jié)果與人類膿毒血癥的相關(guān)性有待進一步研究，但膿毒血癥早期死亡可能主要由上述過度炎癥反應(yīng)導(dǎo)致。

1.2 膿毒血癥期間免疫抑制

1.2.1 淋巴細胞的衰竭和凋亡 膿毒血癥期間免疫抑制可歸結(jié)為淋巴細胞減少和免疫功能喪失，且淋巴細胞衰竭和凋亡是膿毒血癥免疫抑制的重要原因［10-11］。膿毒血癥期間，抗原負(fù)荷高而促炎和抗炎細胞因子釋放增多，是導(dǎo)致T細胞衰竭的重要原因。BOOMER等［12］測定了快速收集的40例膿毒血癥死亡患者脾臟組織中細胞因子分泌和免疫細胞表面受體及其配體表達，確定了免疫抑制這種潛在機制，多角度證明了T細胞衰竭：①相比于對照組，受刺激的膿毒血癥患者T細胞分泌的細胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-10）減少；②CD4+T細胞程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）和巨噬細胞PD-1配體（PD-ligand 1，PD-L1）表達增加；③T細胞CD127（IL-7受體α鏈）表達降低，是T細胞衰竭的另一表型。此外，該研究發(fā)現(xiàn)膿毒血癥患者毛細血管內(nèi)皮細胞和支氣管上皮細胞PD-L1表達增加，已遷移到感染部位的T細胞功能受損，從而宿主根除致病微生物的能力嚴(yán)重受損［13］。另有研究表明，膿毒血癥患者循環(huán)T細胞中PD-1表達升高與T細胞增殖能力下降、院內(nèi)感染增加和病死率升高有關(guān)，為膿毒血癥患者T細胞衰竭與膿毒血癥發(fā)病和病死率存在潛在因果關(guān)系提供了依據(jù)［14］。動物研究表明抑制PD-1/PD-L1相互作用可提高一些膿毒血癥臨床相關(guān)模型存活率，與非膿毒血癥患者相比，膿毒血癥患者淋巴細胞PD-1高表達會減少IFN-γ和IL-2產(chǎn)生，因此阻斷PD-1/PD-L1途徑可作為膿毒血癥治療的重要靶點［15］。

1.2.2 抗原遞呈細胞的代謝重編程 免疫抑制導(dǎo)致膿毒血癥患者單核/巨噬細胞功能障礙的標(biāo)志為受到LPS、其他TLR激動劑或細菌（或其他微生物，如真菌）再次刺激時，其釋放促炎細胞因子的能力衰退，與膿毒血癥中內(nèi)毒素耐受現(xiàn)象一致。免疫抑制期間膿毒血癥患者血液單核細胞HLA-DR表達降低，刺激后通常表現(xiàn)出較低的促炎細胞因子（如TNF-α、IL-1α、IL-6和IL-12）釋放能力，而未削弱甚至增強了抗炎遞質(zhì)（如IL-1受體拮抗劑和IL-10）釋放能力［16］。表明雖然LPS仍可激活單核/巨噬細胞，但細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)為產(chǎn)生抗炎分子。促炎和抗炎因子釋放平衡一旦破壞，單核/巨噬細胞將發(fā)生代謝重編程［17］。由前期“炎癥風(fēng)暴”向后期免疫抑制轉(zhuǎn)變的膿毒血癥患者會改變其單核/巨噬細胞內(nèi)糖酵解相關(guān)基因表達，致使免疫耐受期膿毒血癥患者糖酵解和氧化代謝多重缺陷。目前，基因功能重編程已被認(rèn)為是膿毒血癥患者調(diào)節(jié)免疫細胞功能的重要機制，調(diào)控染色質(zhì)基因位點轉(zhuǎn)錄活性或沉默狀態(tài)。雖然常染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄活性可通過轉(zhuǎn)錄因子和聚合酶獲得，但異染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄沉默很難獲得，從而導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄受抑制。細胞代謝重編程還受特異性 microRNA（miRNA）影響，通過miRNA進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控會靶向降解特定mRNA，致使其相關(guān)蛋白表達下調(diào)［18］。因此，表觀遺傳重塑可作為治療免疫抑制的有效手段，主要通過調(diào)控免疫細胞基因轉(zhuǎn)錄狀態(tài)發(fā)揮作用［19］。

2 膿毒血癥治療進展

2.1 TLR4通路抑制劑 細胞表面受體TLR4激活對LPS引起的膿毒血癥和膿毒血癥休克具有決定性影響，因此針對TLR4相關(guān)靶點蛋白研發(fā)設(shè)計了大量藥物。GAO等［20］研究發(fā)現(xiàn)，總丹參酮通過阻斷TLR4二聚化抑制MyD88-TAK1-NF-κB/MAPK信號級聯(lián)反應(yīng)在體內(nèi)和體外發(fā)揮抗炎作用。K?SE-VOGEL等［21］研究發(fā)現(xiàn)，低劑量蒽環(huán)類藥物可在原代巨噬細胞中抑制NLRP3炎癥體活化和細胞因子釋放，進而減弱炎癥性巨噬細胞反應(yīng)。IPPAGUNTA等［22］研究發(fā)現(xiàn)，作為TLR特異性抑制劑的甲基哌啶吡唑（methyl-piperidino-pyrazole，MPP）可靶向MyD88的TIR結(jié)構(gòu)域保護TLR4依賴性炎癥小鼠。IC14是一種識別CD14的重組嵌合單克隆抗體（mAb），為確定其阻斷CD14介導(dǎo)的細胞活化開展了一項關(guān)于IC14抗體治療膿毒血癥誘導(dǎo)的急性肺損傷患者的Ⅱ期臨床試驗（NCT00233207），但由于無法達到臨床研究的有效注冊人數(shù)，該研究于2007年終止，IC14治療膿毒血癥及其相關(guān)疾病的療效研究也未被進一步闡明。起初一些用于治療膿毒血癥的藥物雖然在細胞和動物實驗上表現(xiàn)出了明顯效果，甚至有些已用于臨床前研究，但最終均以失敗告終。Eritoran（一種合成的TLR4拮抗劑）可與LPS競爭性結(jié)合細胞表面TLR4/MD-2受體。一項調(diào)查Eritoran影響膿毒血癥誘導(dǎo)死亡Ⅲ期臨床試驗（NCT00334828）結(jié)果表明，與接受安慰劑治療相比，接受Eritoran治療的嚴(yán)重膿毒血癥患者28 d病死率并未降低。多黏菌素 B（polymyxin B，PMB）已被證明可降低膿毒血癥患者血液內(nèi)毒素水平。為研究PMB血液灌注降低循環(huán)內(nèi)毒素水平是否會改善膿毒血癥患者病死率，一項臨床試驗（NCT00629382）對其有效性進行了驗證，但結(jié)果卻顯示與常規(guī)藥物治療中添加安慰劑相比，添加PMB血液灌注未降低嚴(yán)重膿毒血癥患者28 d病死率。作為TLR4介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的小分子抑制劑TAK-242也無法抑制膿毒血癥休克或呼吸衰竭患者細胞炎癥因子水平，與接受安慰劑治療組患者相比，接受高劑量TAK-242治療的部分膿毒血癥休克和呼吸衰竭患者病死率并未降低。因此，TLR4抑制劑在臨床試驗中可能無法滿足抗膿毒血癥藥物期望。一旦膿毒血癥發(fā)生，TLR4抑制劑對膿毒血癥治療過于滯后，從而無法逆轉(zhuǎn)該疾病發(fā)生。

2.2 靶向細胞凋亡的PD-1/PD-L1途徑 PD-1和PD-L1表達增加在膿毒血癥相關(guān)免疫抑制反應(yīng)中起重要作用，SHINDO等［23］研究表明，真菌性膿毒血癥模型中，PD-L1的抑制性抗體——新型短肽（Anti-PD-L1 peptide）可阻斷PD-1與PD-L1相互作用，逆轉(zhuǎn)T細胞功能障礙，提高膿毒血癥患者生存率。HUANG等［24］研究發(fā)現(xiàn)，作為免疫抑制劑的霉酚酸酯（mycophenolate mofetil，MMF）通過抑制細胞因子釋放和PD-1表達保護膿毒血癥小鼠。一份關(guān)于傳統(tǒng)療法治療真菌性膿毒血癥婦女無效的病例報告表明，Nivolumab（抗PD-1抗體）和IFN-γ聯(lián)用可恢復(fù)免疫功能并清除侵襲性感染，且Nivolumab和IFN-γ聯(lián)合治療在慢性丙型肝炎病毒感染患者中已表現(xiàn)出顯著活性［25］。

2.3 炎癥因子mRNA表達抑制 miRNA是基因表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，可控制約30%哺乳動物所有蛋白編碼基因活性，已證明其參與了幾乎每個細胞過程調(diào)控［18］。此外，miRNA通過干擾其驅(qū)動的互補基因?qū)崿F(xiàn)對mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，從而定向降解特定mRNA并下調(diào)相關(guān)蛋白表達。ZHEN等［26］研究表明，膿毒血癥小鼠體內(nèi)miR-9基因表達增加，而敲低miR-9則部分逆轉(zhuǎn)了膿毒血癥小鼠IL-6和TNF-α上調(diào)，并延長了膿毒血癥小鼠生存期。KANG等結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表觀基因組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，IFN-γ通過抑制TLR4介導(dǎo)的基因激活選擇性消除LPS誘導(dǎo)的反饋并影響巨噬細胞活化［27］。ROSSATO等［28］研究表明，IL-10誘導(dǎo)的miR-187直接靶向TNF-α mRNA穩(wěn)定性和翻譯，并通過下調(diào)IκBζ（間接調(diào)節(jié)這兩種細胞因子轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)控因子）間接降低IL-6和IL-12p40表達，證明miR-187在IL-10驅(qū)動的抗炎反應(yīng)生理調(diào)節(jié)具有核心作用。IL-10持續(xù)釋放可能有助于增強膿毒血癥誘導(dǎo)的免疫抑制，阻斷IL-10則可逆轉(zhuǎn)膿毒血癥相關(guān)動物模型中膿毒血癥誘導(dǎo)的免疫抑制并提高生存率［29］。IL-10高表達也與單核細胞人白細胞抗原-DR（human leukocyte antigen DR，HLA-DR）低表達相關(guān)，且單核細胞HLA-DR表達降低是膿毒血癥誘導(dǎo)的免疫抑制研究最多的生物標(biāo)志物。與mHLA-DR表達迅速增加患者相比，mHLA-DR表達延遲或未改善/下降患者發(fā)生不良事件風(fēng)險更高，但其與mHLA-DR表達動力學(xué)無關(guān)，因此HLA-DR可作為治療膿毒血癥免疫抑制的有效靶點［30］。SRISAWAT等［31］研究發(fā)現(xiàn)，重癥膿毒血癥患者中接受PMB血液灌流增加了mHLA-DR表達并改善了預(yù)后，表明其在mHLA-DR低表達患者中具有潛在益處。孟強等［32］研究發(fā)現(xiàn)，血液濾過治療通過上調(diào)患者血漿HLA-DR表達顯著減少血漿中抗炎細胞因子IL-10表達，改善預(yù)后并減輕患者危重程度。

3 總結(jié)與展望

膿毒血癥發(fā)病機制十分復(fù)雜，目前治療仍存在很多困難與挑戰(zhàn)，了解膿毒血癥發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的全過程，在發(fā)病不同階段給予精確診斷和治療顯得尤為重要。如今市面上的抗菌藥在治療膿毒血癥早期感染中具有不可或缺的地位，但對感染后期引起的免疫抑制毫無作用，甚至很多出院患者仍長期伴有各種后遺癥，包括認(rèn)知和身體障礙及心血管疾病，病死率也存在提高風(fēng)險，進一步強調(diào)了膿毒血癥對衛(wèi)生保健和社會的影響。全面掌握膿毒血癥發(fā)病機制對其治療的精準(zhǔn)把控至關(guān)重要。不僅需要在感染前期清除炎癥誘發(fā)物并抑制機體持續(xù)炎癥反應(yīng)，還需要對后期機體發(fā)生的免疫抑制進行免疫治療，尤其是機體出現(xiàn)嚴(yán)重免疫衰竭的患者。