周靖軒 袁春玲 向晨焱 王 君 鄒黎黎

（三峽大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，感染與炎癥損傷研究所，宜昌 443000）

泌尿系感染（urinary tract infections，UTI）每年困擾著全球約1.5億人，約有50%的女性在其生命周期中被UTI所困擾，其中25%的女性在首次感染后6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)性尿路感染（recurrent UTI， rUTI），甚至部分患者在初次發(fā)生感染后1年內(nèi)出現(xiàn)6次以上的反復(fù)感染，嚴(yán)重影響患者的生理和心理健康。導(dǎo)致UTI最常見(jiàn)的病原體是尿路致病性大腸桿菌（uropathogenicE.coli，UPEC），約80%的社區(qū)獲得性UTI和50%的院內(nèi)UTI均由UPEC引起［1-5］。在感染發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，宿主表現(xiàn)出復(fù)雜的主要由尿路上皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫防御能力，如尿路上皮細(xì)胞的屏障作用、中性粒細(xì)胞的遷移和吞噬作用。除此之外，還有細(xì)胞因子的殺傷作用等［6-7］；同時(shí)，UPEC的自身結(jié)構(gòu)合并其分泌的毒力因子可打破宿主屏障，并對(duì)抗中性粒細(xì)胞的免疫應(yīng)答以逃避宿主的免疫清除。鑒于感染期間復(fù)雜的病原體-宿主反應(yīng)與病原體的侵入和反復(fù)感染密切相關(guān)，因此深入理解UTI中宿主-病原體的免疫相互作用勢(shì)在必行，以期為臨床治療提供一定的參考。

1 膀胱上皮

膀胱上皮細(xì)胞（bladder epithelial cells，BEC）是宿主抵抗病原體入侵的第一道防線，其不僅是一個(gè)高度致密的物理屏障，其上分布的各種細(xì)菌受體也可高效抵御UPEC感染。膀胱上皮（即移行上皮）由基底細(xì)胞層、中間細(xì)胞層和淺表頂層組成。淺表頂層也被稱為傘狀細(xì)胞，其表面有由尿空斑蛋白（uroplakins，UPs）組成的剛性斑塊，在維持屏障方面發(fā)揮著重要作用［8］。即便如此，UPEC仍可依靠各種生物作用打破BEC的防御作用［9］：①黏附作用。KAPER等［10］，DUNCAN等［11］和CHAHALES等［12］研究發(fā)現(xiàn)，UPEC可通過(guò)與UPs結(jié)合而黏附至宿主細(xì)胞，雖然排尿期間尿液的沖刷作用可排出大部分的細(xì)菌，但殘留的細(xì)菌會(huì)在營(yíng)養(yǎng)豐富的尿液中完成增殖并定殖于尿道上皮。②入胞作用。傘狀細(xì)胞中具有膜運(yùn)輸作用的細(xì)胞器：梭形囊泡（fusiform vesicles，F(xiàn)V），其功能受特定細(xì)胞膜內(nèi)面的Rab GTP酶調(diào)節(jié)。BEC含有大量由RAB27b調(diào)節(jié)的FV，正常生理情況下FV作為額外膜儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)尿液積聚導(dǎo)致膀胱擴(kuò)張時(shí)，F(xiàn)V以cAMP依賴性方式發(fā)生胞吐作用以提供膀胱擴(kuò)張所需的額外膜；排尿后額外膜再次以FV的形式回到細(xì)胞內(nèi)［13-15］。為了侵入上皮細(xì)胞，UPEC在細(xì)菌黏附的部位觸發(fā)局部cAMP爆發(fā)導(dǎo)致FV融合至細(xì)胞膜。當(dāng)這些膜回到細(xì)胞內(nèi)時(shí)，黏附在細(xì)胞膜上的細(xì)菌被包裹在FV中從而進(jìn)入上皮細(xì)胞內(nèi)［9，14］。藏匿在FV中的UPEC不僅無(wú)法被溶酶體吞噬，而且可以迅速?gòu)?fù)制形成細(xì)胞內(nèi)菌落（intracellular bacterial community，IBC）。這種結(jié)構(gòu)具有生物膜樣特性，可抵抗宿主先天防御和抗生素的殺傷［16-17］。③抑制溶酶體的吞噬作用。如上所述，膀胱上皮細(xì)胞表面具有迅速識(shí)別細(xì)菌入侵的受體，如Toll樣受體（TLR2、TLR4、TLR5和TLR11）［18］。SONG等［19］研究發(fā)現(xiàn)，TLR4被激活后可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平導(dǎo)致FV發(fā)生胞吐使得囊泡內(nèi)細(xì)菌被清除至膀胱腔。為了躲避Toll受體介導(dǎo)的清除作用，UPEC從FV中逃逸至細(xì)胞質(zhì)，此時(shí)細(xì)胞的自噬系統(tǒng)被激活，細(xì)菌被包裹在自噬體中并通過(guò)多泡體轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體。然而，UPEC可調(diào)節(jié)PH值使溶酶體失活并在溶酶體內(nèi)存活，這些失活溶酶體被位于溶酶體膜上的瞬時(shí)受體電位黏蛋白3（transient receptor potential mucolipin 3，TRPML3）監(jiān)測(cè)到，隨后迅速被排出到胞外［20］。感染后不久，宿主由TLR4介導(dǎo)的FV胞吐以及自噬相關(guān)的溶酶體排出發(fā)揮作用，這些高效的外排機(jī)制可在24 h內(nèi)排出BEC內(nèi)80%以上的細(xì)菌［14］。④上皮脫落。當(dāng)所有外排機(jī)制均無(wú)法有效清除UPEC時(shí)，BEC激活最后一道防線即上皮脫落，從而清除被細(xì)菌黏附和感染的上皮細(xì)胞。BEC剝脫對(duì)于UPEC的清除至關(guān)重要，尤其是作為針對(duì)細(xì)胞內(nèi)UPEC的一線防御［21］。嚴(yán)重感染者的尿液中含有大量脫落的BEC，表明上皮脫落是 一種常用的宿主防御機(jī)制［22-23］。上皮脫落由胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-8相關(guān)的凋亡引起，為了對(duì)抗這種劇烈刺激，基底上皮迅速轉(zhuǎn)變?yōu)榭焖僭鲋碃顟B(tài)，在數(shù)小時(shí)內(nèi)迅速替換脫落細(xì)胞并恢復(fù)尿路上皮屏障［24-25］。新近研究發(fā)現(xiàn)BEC死亡與NLRP3炎癥體途徑的激活和胱天蛋白酶-1激活有關(guān)［21］。然而，感染的BEC引發(fā)的上皮脫落是一把雙刃劍，雖然它可以消除大量細(xì)菌，但也會(huì)使稚嫩細(xì)胞暴露于尿液中的細(xì)菌［23］。實(shí)際上，表面上皮細(xì)胞的死亡是由某些毒性UPEC有意誘導(dǎo)，以更好地到達(dá)BEC深層以形成靜止的細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)庫(kù)（quiescent intracellular reservoirs，QIR），從而在上皮細(xì)胞中持續(xù)存在。因此，上皮細(xì)胞中QIR的存在與膀胱感染的高復(fù)發(fā)和抗生素耐藥密切相關(guān)［26］。

綜上可知，BEC強(qiáng)大的屏障功能，高效的細(xì)菌外排機(jī)制以及徹底的上皮脫落能夠有效抵御細(xì)菌的黏附與侵入。然而，病原體依舊可利用細(xì)胞膜上的UPs黏附至細(xì)胞表面，利用膀胱膜運(yùn)輸特性進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)形成IBC，在上皮脫落時(shí)入侵上皮細(xì)胞形成QIR，導(dǎo)致UTI的反復(fù)復(fù)發(fā)與治療難度增加。

2 中性粒細(xì)胞

中性粒細(xì)胞是膀胱炎發(fā)生后機(jī)體清除細(xì)菌的主要吞噬細(xì)胞，細(xì)菌入侵時(shí)激活BEC表面的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）從而分泌IL-8，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞離開血管遷移至固有層，穿透基底膜和淺表上皮進(jìn)入膀胱腔清除細(xì)菌［27-28］。但是那些被巨噬細(xì)胞分泌的CXC趨化因子配體1（CXCL1）和巨噬細(xì)胞遷移抑制因子募集來(lái)的中性粒細(xì)胞需要局部的腫瘤壞死因子信號(hào)傳導(dǎo)才能穿過(guò)上皮的基底膜［27］。此外中性粒細(xì)胞的跨上皮運(yùn)動(dòng)也需要TNF，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞LY6C分泌第二波細(xì)胞因子，主要是CXCL2。它可以刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶9，和IL-10一起啟動(dòng)中性粒細(xì)胞跨上皮運(yùn)動(dòng)［29］。中性粒細(xì)胞數(shù)量與細(xì)菌負(fù)荷成正比，在感染后2 h內(nèi)到達(dá)膀胱上皮并在6 h達(dá)峰［30］。HARAOKA等［31］研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞反應(yīng)缺陷的小鼠對(duì)UTI的易感性顯著增加且清除細(xì)菌感染的能力降低，表明中性粒細(xì)胞在細(xì)菌清除中扮演重要角色。中性粒細(xì)胞可將高水平的鋅調(diào)集至被吞噬的微生物，利用鋅的毒性可能是保守的先天免疫抗微生物反應(yīng)［32］。但中性粒細(xì)胞釋放的活性氧和細(xì)胞毒性產(chǎn)物可介導(dǎo)組織損傷。HANNAN等［33］研究發(fā)現(xiàn)，非甾體抗炎藥（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDS）或環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）抑制劑對(duì)小鼠UTI具有顯著的治療效果。COX-2抑制劑在不影響B(tài)EC剝落和其他宿主固有清除的情況下限制中性粒細(xì)胞遷移至泌尿道，減少膿尿和黏膜損傷并降低慢性膀胱炎的發(fā)生率。雖然中性粒細(xì)胞可確保機(jī)體在排泄過(guò)程中及時(shí)清除細(xì)菌，但是中性粒細(xì)胞的募集在UTI期間可引起嚴(yán)重病理反應(yīng)，表明尿液中大量的中性粒細(xì)胞是宿主防御的副產(chǎn)物［31］。然而過(guò)度的免疫應(yīng)答也與炎癥疾病有關(guān)。新近研究表明Forskolin可明顯減少小鼠炎癥組織中CD45+Ly6G+細(xì)胞（中性粒細(xì)胞高度特異性）的數(shù)量，適當(dāng)減少中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生減輕病理反應(yīng)［34］。此外，F(xiàn)orskolin治療的小鼠也可降低中性粒細(xì)胞IL-1β和TNF-α mRNA的表達(dá)。中性粒細(xì)胞的耗竭不僅可以減緩組織破壞，同時(shí)也可以減少細(xì)菌負(fù)荷［34］。

UPEC具有針對(duì)中性粒細(xì)胞募集和吞噬功能的毒力機(jī)制，通過(guò)下調(diào)中性粒細(xì)胞趨化、促炎、黏附和遷移相關(guān)的基因表達(dá)抑制中性粒細(xì)胞遷移。①上調(diào)吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）表達(dá)。UPEC在體外以及細(xì)菌性膀胱炎的小鼠模型中均可誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物IDO1基因的局部表達(dá)［35］。研究表明，UPEC可減少體內(nèi)外中性粒細(xì)胞經(jīng)膀胱上皮的遷移，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和尿路上皮細(xì)胞內(nèi)的抗炎分子產(chǎn)生，如IDO［36-38］。IDO可介導(dǎo)犬尿氨酸的產(chǎn)生，在體外對(duì)黏附性中性粒細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析表明犬尿氨酸直接影響中性粒細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)［35］。IDO參與色氨酸分解代謝，通過(guò)色氨酸局部匱乏以及犬尿氨酸的局部代謝分解產(chǎn)物來(lái)調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫；UPEC在侵入小鼠膀胱后1 h內(nèi)局部特異性上調(diào)IDO，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞募集減弱；IDO缺陷小鼠中性粒細(xì)胞在UTI中遷移增強(qiáng)，使細(xì)胞外細(xì)菌的殺傷增加和感染減弱［35，39］。且進(jìn)一步研究表明，UPEC會(huì)在膀胱炎期間誘導(dǎo)局部TNF-α分泌，從而破壞先天性免疫介導(dǎo)的鋅毒性，TNF-α和IFN-γ的持續(xù)作用是UPEC誘導(dǎo)宿主中IDO上調(diào)的基礎(chǔ)［39-41］。②釋放YbcL。LAU等［38，42］的研究證實(shí)，隨細(xì)菌裂解而釋放存在于細(xì)菌周質(zhì)中的效應(yīng)物YbcL，可在體內(nèi)和體外模型中抑制中性粒細(xì)胞跨上皮遷移。YbcL抑制中性粒細(xì)胞遷移需要尿路上皮細(xì)胞，并通過(guò)細(xì)菌暴露于BEC而增加細(xì)菌裂解從而達(dá)到釋放YbcL的目的［42］。③分泌α溶血素。為了抵抗中性粒細(xì)胞的吞噬， UPEC分泌α溶血素發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抑制粒細(xì)胞的趨化及吞噬活性作用［43-46］。④分化成絲。在IBC成熟期間，少數(shù)細(xì)胞菌落通過(guò)分化途徑形成長(zhǎng)度70 μm的非分離的絲狀細(xì)菌［16，47］。當(dāng)含有IBC的上皮細(xì)胞裂解時(shí)，UPEC從IBC中流出進(jìn)入膀胱腔，而絲狀UPEC（1～2 μm）則可以抵抗吞噬作用［16，48］。事實(shí)上，中性粒細(xì)胞能夠吞噬比自身更大的顆粒（例如真菌菌絲），絲狀UPEC的抗吞噬作用可能依賴于其大小超出吞噬的極限［16，49-50］。綜上可知，中性粒細(xì)胞在UTI過(guò)程中募集和吞噬清除病原體，而UPEC為了抵抗中性粒細(xì)胞的免疫清除作用，上調(diào)IDO的表達(dá)、釋放YbcL、分泌α溶血素抑制中性粒細(xì)胞的遷移與募集，還可分化成絲以逃避中性粒細(xì)胞的吞噬。

3 抗菌因子

泌尿道炎癥反應(yīng)主要通過(guò)激活Toll樣受體（TLR）而引發(fā)。UPEC感染后不久，PRR即被激活，細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激TLR4激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）途徑或誘導(dǎo)尿路上皮cAMP的增加進(jìn)而導(dǎo)致IL-6和IL-8表達(dá)增加［51-53］。此外，NOD-樣受體/胱天蛋白酶-1途徑的激活也會(huì)導(dǎo)致IL-6和IL-1β的大量爆發(fā)［21，51］。這些細(xì)胞因子與BEC分泌的其他炎癥介質(zhì)一起導(dǎo)致免疫細(xì)胞迅速流入上皮細(xì)胞以抵抗細(xì)菌攻擊，如抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP），抗菌蛋白。Cathelicidin LL-37是由BEC分泌的小分子量的陽(yáng)離子AMP，可直接殺死細(xì)菌。CHROMEK等［54］研究發(fā)現(xiàn)，感染5 min后BEC內(nèi)的cathelicidin mRNA表達(dá)升高，敲除LL-37直系同源物的小鼠感染后1 h內(nèi)膀胱UPEC負(fù)荷急劇增加，揭示了AMP快速和強(qiáng)大的抗菌作用。UTI期間防御素類AMP β-防御素也局限性增加［55］。這兩種AMP都有助于細(xì)胞因子的產(chǎn)生、中性粒細(xì)胞的募集、溶解或抑制黏附細(xì)菌［56］。最近研究發(fā)現(xiàn)，可溶性模式識(shí)別分子五聚蛋白相關(guān)蛋白3（pentraxin-related protein，PTX3）可刺激補(bǔ)體介導(dǎo)吞噬從而預(yù)防UTI。感染后泌尿道中PTX3水平增加，PTX3敲除小鼠的抗感染能力降低。此外，核糖核酸酶7是另一種抗菌劑，對(duì)許多常見(jiàn)尿路病原體具有迅速和廣譜的殺菌活性［57］。

為了應(yīng)對(duì)機(jī)體細(xì)胞因子與炎癥介質(zhì)的作用，UPEC可通過(guò)：LPS修飾和效應(yīng)子顯著抑制抗菌因子的產(chǎn)生。UPEC可以穩(wěn)定NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）從而抑制NF-κB活性并增加BEC凋亡［58］。研究發(fā)現(xiàn)，多個(gè)UPEC分離株可在尿路上皮細(xì)胞誘導(dǎo)低水平的IL-6和IL-8，并與已知的NF-κB刺激物共接種后能夠阻止這些炎癥細(xì)胞因子的分泌［59-60］。LPS的生物合成在其中發(fā)揮重要作用，UPEC LPS修飾可能產(chǎn)生一個(gè)低刺激性的LPS結(jié)構(gòu)，抑或者是非刺激性LPS發(fā)揮主導(dǎo)作用［59，61］。然而，僅僅是LPS差異并不能解釋細(xì)胞因子的抑制，其他機(jī)制和UPEC效應(yīng)也可能有助于抑制細(xì)胞因子的分泌，例如亞裂解濃度的α溶血素可抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)以及IL-6的分泌［62-65］。大部分UPEC編碼含有Toll/IL-1受體（TIR）結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，稱為TcpC，與宿主銜接子MyD88相互作用以抑制TLR信號(hào)傳導(dǎo)［66］。關(guān)于TIR結(jié)構(gòu)域蛋白其他信號(hào)通路的進(jìn)一步研究表明，TcpC可獨(dú)立于MyD88調(diào)節(jié)TLR通路， 因此TcpC可能以更廣泛的方式影響發(fā)病機(jī)制［67］。NLRP3炎癥小體和IL-1β對(duì)于UTI的建立和發(fā)展都是非常重要的，UPEC是可調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體激活和IL-1β釋放的毒力因子，從而影響UPEC BEC的黏附與定植［21，68-70］?？傊?，在UTI期間尿路上皮分泌細(xì)胞因子、AMP和抗菌蛋白抑制或殺傷病原體，然而UPEC可通過(guò)LPS修飾和效應(yīng)子抑制炎癥因子的產(chǎn)生從而逃避宿主的清除，且一些促炎細(xì)胞因子具有改變UPEC毒性特征的能力［71］。即便如此，目前AMP作為疫苗抗原用于抗擊UTI的新策略的疫苗開發(fā)上。此外，鐵載體，黏附素等也可以成功防御UTI［72-75］。了解這些細(xì)胞因子是如何影響UPEC以及宿主的免疫防御，對(duì)制定針對(duì)這些細(xì)胞因子為靶標(biāo)替代傳統(tǒng)抗生素的治療策略至關(guān)重要。

4 展望

UTI中宿主與病原體的免疫相互作用極其復(fù)雜，詳細(xì)深刻的理解其機(jī)制有助于開發(fā)新的治療方法，比如針對(duì)病原體的黏附和生物膜形成過(guò)程、破壞細(xì)菌對(duì)中心粒細(xì)胞、細(xì)胞因子的抑制；針對(duì)宿主刺激感染的組織細(xì)胞對(duì)病原體侵襲反應(yīng)增強(qiáng)從而引發(fā)和增強(qiáng)免疫反應(yīng)。針對(duì)UPEC感染治療的直接策略是針對(duì)細(xì)菌的生存力，膀胱上皮的黏附和生物膜的形成。而間接策略是通過(guò)刺激受感染的組織和細(xì)胞對(duì)UPEC入侵過(guò)度反應(yīng)引發(fā)和增強(qiáng)免疫反應(yīng)［76］。然而宿主的炎癥反應(yīng)是一把雙刃劍，急性膀胱炎期間過(guò)度旺盛的炎癥可增加組織的損傷，更容易發(fā)展為慢性復(fù)發(fā)性感染，導(dǎo)致病原體持久駐留在上皮內(nèi)而無(wú)法被免疫系統(tǒng)清除。因此，宿主需要進(jìn)行精細(xì)的免疫調(diào)節(jié)以消除尿路病原體，同時(shí)避免可能增加疾病嚴(yán)重性或促進(jìn)持續(xù)感染的炎癥反應(yīng)。一旦形成慢性復(fù)發(fā)性感染，需要開發(fā)新的治療方法以徹底清除細(xì)胞內(nèi)駐留的細(xì)菌。關(guān)于泌尿系感染中宿主-病原體免疫相互作用的詳細(xì)機(jī)制和相對(duì)應(yīng)的治療措施，亟待下一步研究。