張麗芳，張淼怡，劉宇奇，鄭百芹，周璇，谷守國

1. 唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心（唐山 063000）；2. 河北省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)創(chuàng)新中心（唐山 063000）；3. 唐山市功能性農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院（唐山 063000）

乳及乳制品中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)元素，在日常飲食中占據(jù)越來越重要的地位，其質(zhì)量安全問題也越來越受到關(guān)注。亞硝酸鹽廣泛存在于土壤、地表水、植物和生物系統(tǒng)中。亞硝酸鹽與食品中固有的胺類化合物是產(chǎn)生亞硝胺的前體物質(zhì)，亞硝胺在動物試驗中被證實為致癌物。大量攝入亞硝酸鹽可誘導(dǎo)高鐵血紅蛋白血癥，導(dǎo)致組織缺氧[1-2]。新生嬰兒對亞硝酸鹽非常敏感，且乳制品攝入量大。奶牛的養(yǎng)殖環(huán)境、飼養(yǎng)用水及飼料中亞硝酸鹽含量過高，有可能導(dǎo)致牛乳中的亞硝酸鹽含量超標(biāo)[3]。因此對乳品中亞硝酸鹽進(jìn)行安全監(jiān)控十分必要[4]。

鑒于亞硝酸鹽對人體的危害性，各國制定食品中亞硝酸鹽的添加量和殘留量相關(guān)限量。世界衛(wèi)生組織食品添加物聯(lián)合專家委員會規(guī)定：亞硝酸鹽每日攝取安全容許量為0～0.06 mg/kg[5]。GB 2762—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》[6]規(guī)定：乳及乳制品中生乳的亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計）不得大于0.4 mg/kg；乳粉及特殊膳食用食品（嬰幼兒配方食品、嬰幼兒谷類輔助食品、孕婦及乳母營養(yǎng)補(bǔ)充食品等）亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計）不得大于2 mg/kg。

乳制品中亞硝酸鹽的常見檢測方法有分光光度法、液相色譜法、氣相色譜法、流動注射法、離子色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7-10]。這些方法存在各自的優(yōu)缺點，如：分光光度法操作復(fù)雜，引入鎘污染物，易對環(huán)境造成污染；氣相色譜法靈敏度不高，不能滿足乳制品的限量要求；離子色譜法作為無機(jī)陰離子分析技術(shù)，具有快速、靈敏、選擇性好等優(yōu)點，但GB 5009.33—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》[11]中離子色譜法前處理過程需要過柱，操作復(fù)雜，成本高。試驗采用離子色譜法測定乳及乳制品中亞硝酸鹽含量，通過優(yōu)化前處理條件和篩選色譜分析參數(shù)，旨在建立一種準(zhǔn)確、快速、低成本的檢測方法，為乳及乳制品中亞硝酸鹽的測定研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（1 000 μg/mL，北京北方偉業(yè)計量技術(shù)研究院）；乙腈（色譜純，DiKMA）。

1.2 儀器與設(shè)備

883 Basic IC plus離子色譜儀（瑞士萬通）；PL2002分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；LYNX4000高速低溫冷凍離心機(jī)（Thermo Scientific）；Gd-16高速均質(zhì)機(jī)（新銳科技）。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

1.3.1.1 液態(tài)奶和乳飲料

稱取20 g樣品，精確至0.01 g，至50 mL準(zhǔn)確量值的離心管中，加入乙腈定容至50 mL，充分渦旋振蕩，靜置10 min。樣品按10 000 r/min離心10 min。取液體過0.45 μm水相濾膜后上機(jī)。

1.3.1.2 奶粉

稱取5 g樣品，精確至0.01 g，至50 mL準(zhǔn)確量值的離心管中，用20 mL水復(fù)溶，加入乙腈定容至50 mL，充分渦旋振蕩，靜置10 min。隨后，樣品按10 000 r/min離心10 min。取液體過0.45 μm水相濾膜后上機(jī)。

1.3.1.3 干酪

稱取2.5 g樣品，精確至0.01 g，至50 mL準(zhǔn)確量值的離心管中，加入20 mL水，加入數(shù)粒陶瓷珠，高速勻漿2 min，超聲30 min，取出放置至室溫，加乙腈定容至50 mL，充分渦旋振蕩，靜置10 min。隨后，樣品按10 000 r/min離心10 min。取液體過0.45 μm水相濾膜后上機(jī)。

1.3.2 色譜條件

色譜柱Metrosep A Suup7-250/4.0；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量50 μL；淋洗液流速0.7 mL/min；淋洗液3.6 mmol/L Na2CO3。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液

精確量取0.1 mL 1 000 μg/mL的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，制備成10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)中間液

精確量取1.0 mL 10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，制備成1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液。

1.3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密吸取0.1，0.2，0.4，0.8，1.0和2.0 mL標(biāo)準(zhǔn)中間液分別至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，制備成0.01，0.02，0.04，0.08，0.10和0.20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.4 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密吸取0.1，0.2，0.4，0.8，1.0和2.0 mL標(biāo)準(zhǔn)中間液分別至10 mL容量瓶中，用基質(zhì)空白提取液定容至刻度，制備成0.01，0.02，0.04，0.08，0.10和0.20 μg/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 計算公式

試樣中亞硝酸鹽（以NO2-計）含量按式（1）計算。

式中：X為試樣中亞硝酸鹽含量，mg/kg；C為試樣中實測亞硝酸鹽質(zhì)量濃度，mg/L；V為試樣溶液體積，mL；f為稀釋倍數(shù)；m為試驗質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的選擇

2.1.1 樣品沉淀劑的選擇

乳及乳制品中測定亞硝酸鹽去除蛋白和脂肪的沉淀劑種類較多，如乙酸鋅+亞鐵氰化鉀、鎢酸鈉+硫酸、冰乙酸、冰乙酸+乙腈、三氯乙酸+乙腈、乙醇等。乙酸鋅+亞鐵氰化鉀對于乳制品有很好的蛋白沉淀效果，是液相色譜法和分光光度法常用的沉淀劑，但在離子色譜中這些沉淀試劑會引入大量金屬離子，污染色譜柱，降低離子色譜柱效[12-13]。乙酸沉淀法基線相對較平直，同時亞硝酸根不受乙酸根的影響，但在低體積分?jǐn)?shù)時，亞硝酸鹽可能受pH影響加速轉(zhuǎn)化，使回收率偏低。

乙醇、乙腈是較為理想的蛋白沉淀劑，試驗發(fā)現(xiàn)乙醇的沉淀效果比乙腈的沉淀效果差，選擇乙腈作為蛋白沉淀劑。有機(jī)相與水相的比例會影響蛋白沉淀效果和回收率，比較乙腈與水相的體積比分別為7∶3，6∶4，5∶5，4∶6和3∶7時的沉淀效果和對亞硝酸根回收率的影響，結(jié)果見表1。在20 g液態(tài)奶或乳制品制備成20 mL液態(tài)試樣時，加入約30 mL乙腈（V乙腈∶V水=6∶4），蛋白沉淀效果最理想，未出現(xiàn)分層現(xiàn)象，回收率高，確定為蛋白沉淀的最佳條件。試驗以乙腈為沉淀劑，沉淀效果與回收率（回收率98.4%）均優(yōu)于顏琪等[14]以1∶1的乙腈-3%乙酸為蛋白沉淀劑（回收率97.3%）。

表1 蛋白沉淀劑的選擇

干酪試樣在水中的溶解度低，樣品經(jīng)高速均質(zhì)后超聲提取，亞硝酸鹽回收率優(yōu)于試樣加入水后直接超聲提取。對超聲提取時間進(jìn)行優(yōu)化，亞硝酸鹽回收率隨著超聲時間的延長而提高，到30 min后，回收率趨于穩(wěn)定，因此確定超聲時間為30 min。

2.1.2 分離參數(shù)的優(yōu)化

試樣經(jīng)蛋白沉淀后，離心進(jìn)行分離，以亞硝酸鹽的回收率為評價指標(biāo)，篩選出離心轉(zhuǎn)速與時間，設(shè)計因素與水平見表2，所得結(jié)果見表3。隨著離心轉(zhuǎn)速的提高和時間的延長，蛋白分離效果變好，亞硝酸鹽的回收率提高后趨于平穩(wěn)。結(jié)合操作時間綜合考慮，選擇10 000 r/min、離心時間10 min作為分離參數(shù)。

表2 離心轉(zhuǎn)速和時間對亞硝酸鹽回收率的影響試驗設(shè)計

表3 離心轉(zhuǎn)速和時間對亞硝酸鹽回收率的影響試驗結(jié)果

2.1.3 凈化參數(shù)優(yōu)化

由于乳制品中的氯離子含量較高，奶粉中氯離子含量一般在800～1 000 mg/L[15]。按照GB 5009.33—2016，氯離子濃度大于100 mg/L時，待測液需要依次通過針頭濾器、C18柱、Ag柱和Na柱，去除或降低待測液中氯離子濃度，以降低對亞硝酸鹽的影響，但試驗結(jié)果顯示，亞硝酸根離子的回收率并未受到氯離子的影響，所得結(jié)果與馮偉科等[16]研究結(jié)果一致。試驗方法在離心去除蛋白后，上清液直接過濾膜上機(jī)，不再用Ag柱、Na柱處理，大幅降低檢測成本。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

試驗考察Metrosep A Suup4-250/4.0和Metrosep A Suup7-250/4.0色譜柱對亞硝酸鹽的分離效果。Suup4色譜柱采用的淋洗液為1.8 mmol/L Na2CO3和1.7 mmol/L NaHCO3，流速1.0 mL/min，亞硝酸根的出峰時間為5.20 min，但奶的基質(zhì)有干擾峰，通過調(diào)節(jié)淋洗液和流速并未有所改善。Suup7色譜柱采用3.6 mmol/L Na2CO3為淋洗液，流速0.7 mL/min，亞硝酸根與雜質(zhì)峰能得到很好分離，出峰時間14.4 min。提高淋洗液的離子濃度或流速，離子的保留時間會縮短，但不利于干擾離子與亞硝酸根的分離，流速的增加也顯著增大系統(tǒng)的壓力。綜合考慮，確定采用Metrosep A Suup7-250/4.0色譜柱，3.6 mmol/L Na2CO3為淋洗液，流速0.7 mL/min，作為試驗的色譜條件。標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖和奶粉基質(zhì)色譜圖見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）和奶粉基（B）質(zhì)色譜圖

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effects，ME）是指樣品中除分析物以外的組分，在分析過程中對目標(biāo)物有顯著干擾?；|(zhì)效應(yīng)影響大時會降低方法的靈敏度，影響方法的準(zhǔn)確性，給測定帶來誤差[17]，因此，方法開發(fā)和確證過程中需要對基質(zhì)效應(yīng)做出評價。按照樣品的前處理方法分別制備液態(tài)奶、奶粉、干酪的基質(zhì)空白提取液。分別用基質(zhì)空白提取液和水配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照試驗方法進(jìn)行測定。一般認(rèn)為，基質(zhì)匹配校正曲線斜率與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值在0.85～1.15之間不存在基質(zhì)效應(yīng)[18-19]。試驗液態(tài)奶、奶粉、干酪的基質(zhì)效應(yīng)分別為0.95，0.74和0.68，結(jié)果表明液態(tài)奶的基質(zhì)效應(yīng)較弱，而奶粉和干酪具有較強(qiáng)的抑制作用。分析原因是奶粉和干酪中除了蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物外，有多種不同種類的物質(zhì)，如維生素類、無機(jī)鹽類、植物油類、添加劑等。因此，液態(tài)奶檢測采用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正，奶粉和干酪采用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正。

2.4 方法學(xué)確定

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

選擇0.01，0.02，0.04，0.08，0.10和0.20 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.3.2的儀器條件進(jìn)行測定。以峰面積Y（μs·min）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3倍信噪比確定檢出限，以10倍信噪比為定量限。所得線性方程、線性相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.4.2 方法的回收率與精密度

為驗證方法的可靠性，采用基質(zhì)加標(biāo)法對回收率和精密度進(jìn)行考察，在液態(tài)奶、奶粉和干酪中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備成0.5，1.0和2.0 mg/kg這3個質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平，每個添加水平6個平行。在低、中、高3個濃度條件下，回收率在85.4%～101.3%之間，精密度為1.5%～7.1%。試驗方法具有良好的回收率和精密度，能夠滿足檢測需求，結(jié)果見表5。

表5 方法的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

3 結(jié)論

試驗方法適用于液態(tài)乳、乳粉及干酪乳制品中亞硝酸含量的測定。通過對前處理方法優(yōu)化、流動相的選擇、色譜柱的比較、結(jié)果穩(wěn)定等方面的討論，確定乳及乳制品中亞硝酸鹽分離提取及色譜分析的最佳參數(shù)：蛋白沉淀劑采用乙腈，與試樣的體積比6∶4，按離心轉(zhuǎn)速10 000 r/min、離心時間10 min分離蛋白，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，以3.6 mmol/L Na2CO3為淋洗液，流速為0.7 mL/min，進(jìn)行色譜分析。方法的回收率為85.4%～101.3%，精密度為1.5%～7.1%，滿足檢測需求。奶粉和干酪樣品以基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正，降低基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果的影響。該方法前處理方法簡單、成本低、檢出限低，優(yōu)于國標(biāo)方法，能夠滿足乳及乳制品中亞硝酸鹽的檢測要求，可為食品安全監(jiān)督提供有效的技術(shù)支撐。