張莉，尹翔東，毛鵬煜，席陽紅，楊朝林，顏麟灃

1. 四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院（成都 611130）；2. 四川省茶葉集團(tuán)股份有限公司（宜賓 644007）

近年來，隨著人們生活水平的提升，消費(fèi)者對于綠色健康生活的追求日益增加，色素的使用受到越來越多的關(guān)注。相對于合成色素，從天然產(chǎn)物中提取的天然色素不僅能夠提供著色作用，還具備一定生理活性，有利于消費(fèi)者健康，因此天然色素提取成為熱點(diǎn)關(guān)注的話題。茶綠色素是從鮮茶葉或者綠茶中提取的一種天然色素成分[1-3]，其中主要包含葉綠素及葉綠素銅鈉鹽、黃酮醇、兒茶素、咖啡堿、氨基酸、維生素等活性物質(zhì)[4-6]，研究表明其具有調(diào)節(jié)血糖、血脂、抗腫瘤、抗癌、抗菌、抗氧化等功效[7-9]，被廣泛應(yīng)用于食品加工、醫(yī)藥保健以及日化等領(lǐng)域[10-12]，具有廣闊的市場空間。

枇杷茶是四川省五大良種茶之一，也是我國珍貴又稀少的茶品種，因其茶葉與枇杷葉相似而得名[13]。該品種茶具有肉厚、味濃、耐光、高香等特點(diǎn)，其葉片肥厚，富含綠色素成分，除制作琵琶茶葉售賣外，其殘葉、老葉及淘汰鮮葉等非商品茶可作為綠色素提取的優(yōu)質(zhì)原料，是提高茶葉附加值的有效途徑。對于枇杷茶綠色素提取工藝尚未有相關(guān)報(bào)道。試驗(yàn)以枇杷茶為原料，采用超聲輔助溶劑法提取其綠色素，研究提取工藝以及其穩(wěn)定性，以期為枇杷茶綠色素工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

非商品枇杷茶（采自四川省成都市都江堰市青城山鎮(zhèn)茶坪社區(qū)）。

氯化鈉、無水乙醇、硫酸鎂、氯化鉀、氯化鈣、氯化銅、氯化鋁（均為分析純，成都市科龍化工試劑廠）。

1.2 儀器與設(shè)備

XL-400B多功能粉碎機(jī)（永康市小寶電器有限公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；KQ5200DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；美譜達(dá)UV-6100型紫外分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；5804R離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；AKHL-Ⅲ-24超純水機(jī)（成都康寧試驗(yàn)專用純水設(shè)備廠）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 綠色素的提取工藝

茶葉→干燥（50 ℃）→粉碎→過篩（0.425 mm孔徑篩，40目）→加入乙醇→超聲提取→減壓抽濾→色素提取液

1.3.2 提取液的制備

將采摘的殘葉、老葉及淘汰枇杷茶鮮葉放入烘箱，在50 ℃條件下進(jìn)行烘干后用粉碎機(jī)打粉，茶粉過0.425 mm孔徑（40目）篩，備用。稱取1 g茶粉，按固液比1∶20（g/mL）加入80%乙醇，超聲溫度定為60℃，時(shí)間定為60 min，進(jìn)行色素超聲提取，提取液通過減壓抽濾后，在3 000 r/min條件下離心10 min，再次使用80%乙醇溶液稀釋后即為提取液。

1.3.3 提取液的紫外可見光譜

取一定量的提取液放置于比色皿中，用80%乙醇作為空白對照，用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，掃描波長范圍為550～800 nm，結(jié)果見圖1。最大吸收波長666 nm，與文獻(xiàn)[14-15]的結(jié)果基本一致，表明提取物為茶綠色素，后續(xù)試驗(yàn)吸光度均在666 nm處進(jìn)行測定。

圖1 茶提取液的紫外可見光譜

1.3.4 綠色素提取單因素試驗(yàn)

在提取劑一定的條件下，分別考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（60%～100%）、固液比（1∶5～1∶25 g/mL）、超聲功率（200～600 W）、超聲時(shí)間（30～70 min）和超聲提取溫度（40～80 ℃）對吸光度的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn)

選取影響綠色素提取的5個(gè)主要條件，即乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、超聲功率、超聲時(shí)間、提取溫度為試驗(yàn)因素，采用L16(45)正交試驗(yàn)，以吸光度為評價(jià)指標(biāo)，確定最佳提取工藝，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表見表1。

表1 綠色素提取正交因素水平表

1.3.6 綠色素穩(wěn)定性測定

1.3.6.1 溫度對色素穩(wěn)定性的影響

取1 mL茶綠色素提取液，分別在室溫，40，60，80和100 ℃水浴溫度下放置30 min后，冷卻至室溫，測定其在666 nm處的吸光度，通過對比不同條件下吸光度研究其熱穩(wěn)定性[16]。

1.3.6.2 pH對色素穩(wěn)定性的影響

取1 mL茶綠色素提取液，分別用0.1 mol/L NaOH溶液和0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH為3，5，7，9和11，并定容至50 mL，避光放置1 h后測定其在666 nm處的吸光度，通過對比不同條件下吸光度研究pH對其穩(wěn)定性的影響[17]。

1.3.6.3 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響

取1 mL茶綠色素提取液，分別加入1 mL的0.1 mol/L濃度的K+、Na+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Al3+、Fe2+、Fe3+金屬離子溶液，定容至50 mL，搖勻并置于冰箱4 ℃條件下靜置24 h后測定其在666 nm處的吸光度，通過對比不同條件下吸光度的變化研究金屬離子對其穩(wěn)定性的影響[18]。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對茶綠色素提取的影響

由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，吸光度呈先上升后下降趨勢，乙醇體積分?jǐn)?shù)在80%～90%范圍內(nèi)提取率較高，說明綠色素的極性與此體積分?jǐn)?shù)范圍乙醇的極性接近。葉綠素是茶綠色素中的主要成分，其親水基團(tuán)能與水結(jié)合，綠色素溶于水中，但提取劑中水分較低時(shí)，葉綠素親水基團(tuán)較難與蛋白質(zhì)分離，無法從茶葉類囊膜體中游離，因此提取率降低。乙醇體積分?jǐn)?shù)80%和90%時(shí)，綠色素提取率差異不顯著，但是考慮實(shí)際操作過程中能耗與成本因素，選用80%乙醇為宜。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對茶綠色素吸光度的影響

2.2 固液比對茶綠色素提取的影響

由圖3可知，隨著固液比的下降，吸光度呈現(xiàn)增大趨勢。這是由于固液比下降，有助于乙醇對細(xì)胞膜的滲透，提高綠色素的溶解。固液比1∶20（g/mL）時(shí)，茶綠色素幾乎被完全提取，繼續(xù)提高提取劑用量時(shí)，吸光度增加緩慢。綜合考慮生產(chǎn)成本因素，選用固液比1∶20（g/mL）為宜。

圖3 固液比對茶綠色素吸光度的影響

2.3 超聲功率對茶綠色素提取的影響

由圖4可知，隨著超聲功率的升高，吸光度逐漸上升，但功率超過500 W后，吸光度降低，此現(xiàn)象可能是由于超聲功率達(dá)到一定程度后，引起溫度升高過快，茶綠色素破壞損失，導(dǎo)致吸光度降低。而超聲功率未達(dá)到500 W時(shí)，隨著超聲功率的增加，綠色素能夠更好地從細(xì)胞中游離出來，易于被乙醇溶液萃取。因此，超聲功率500 W時(shí)吸光度最高。

圖4 超聲功率對茶綠色素吸光度的影響

2.4 超聲時(shí)間對茶綠色素提取的影響

由圖5可知，隨著超聲時(shí)間的延長，吸光度先上升，時(shí)間超過60 min時(shí)，吸光度開始降低。這可能是因?yàn)槎虝r(shí)間的超聲處理無法有效破壞細(xì)胞，溶出物較少，吸光度增加速度緩慢。隨著時(shí)間的延長，細(xì)胞在超聲作用下逐漸破碎，有助于綠色素的溶出與萃取，但是過長時(shí)間的超聲處理易引起乙醇揮發(fā)及綠色素的熱變性，從而導(dǎo)致吸光度的下降。因此，選用超聲時(shí)間60 min為宜。

圖5 超聲時(shí)間對茶綠色素吸光度的影響

2.5 超聲提取溫度對茶綠色素提取的影響

由圖6可知，吸光度隨著超聲提取溫度的增加呈先上升后下降趨勢，溫度60 ℃時(shí)吸光度最高。這是由于隨著提取溫度的提升，茶細(xì)胞中纖維素酶及果膠酶的活性逐漸增大，加速纖維素及果膠的分解，有助于綠色素的分離析出，而溫度過高時(shí)，纖維素酶與果膠酶由于熱變性失活，影響綠色素的析出，導(dǎo)致提取率的降低。因此，選用提取溫度60 ℃為宜。

圖6 超聲提取溫度對茶綠色素吸光度的影響

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，吸光度最高的因素水平組合為A2B3C4D1E2。通過極差分析可知，各因素對綠色素提取影響程度大小順序?yàn)锳＞C＞B＞E＞D，即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲功率＞固液比＞超聲提取溫度＞超聲時(shí)間，理論最佳因素水平組合為A3B3C4D4E2。

表2 正交試驗(yàn)表

選擇A3B3C4D4E2因素水平組進(jìn)行驗(yàn)證，即選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，固液比1∶20（g/mL），超聲功率600 W，超聲時(shí)間70 min，提取溫度50 ℃，在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測定其吸光度后取平均值，結(jié)果為1.010 5，高于A2B3C4D1E2組吸光度，因此最佳因素水平組為A3B3C4D4E2。

2.7 茶綠色素穩(wěn)定性研究

2.7.1 溫度對茶綠色素穩(wěn)定性的影響

由表3可知，溶液顏色無變化，吸光度變化差異不大，說明綠色素對熱穩(wěn)定性良好。

表3 溫度對茶綠色素穩(wěn)定性的影響

2.7.2 pH對茶綠色素穩(wěn)定性的影響

由表4可知，酸堿性對茶綠色素影響較大，色素顏色有顯著差異。酸性、中性及弱堿性（pH≤9）條件下色素溶液基本保持黃綠色，吸光度變化不大；然而在強(qiáng)堿性條件下，色素溶液呈現(xiàn)棕色，且存在沉淀物析出。因此，茶綠色素水溶液在酸性、中性及弱堿性介質(zhì)中較為穩(wěn)定，在堿性條件下穩(wěn)定性較差。

表4 pH對茶綠色素穩(wěn)定性的影響

2.7.3 金屬離子對茶綠色素穩(wěn)定性的影響

由表5可知：綠色素溶液中加入Fe2+、Fe3+離子后產(chǎn)生增色效應(yīng)，吸光度增加，且產(chǎn)生黑褐色沉淀；加入Al3+離子后也發(fā)生較大變化，吸光度增加且析出黃色沉淀；其他金屬離子加入綠色素后無顯著變化，說明茶綠色素對于Al3+、Fe2+、Fe3+穩(wěn)定性較差，對于其他金屬離子均具有較好的穩(wěn)定性。因此，在生產(chǎn)或使用過程中應(yīng)避免與鐵質(zhì)容器等發(fā)生直接接觸。

表5 金屬離子對茶綠色素穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)確定非商品枇杷茶中綠色素最佳提取工藝參數(shù)：乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、固液比1∶20（g/mL）、超聲功率600 W、超聲時(shí)間70 min、超聲提取溫度50 ℃。在此工藝下提取的綠色素?zé)岱€(wěn)定性較強(qiáng)，在酸性、中性及弱堿性（pH≤9）環(huán)境中穩(wěn)定性良好，K+、Na+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+等大部分離子對茶綠色素影響不大，但強(qiáng)堿性條件及Al3+、Fe2+、Fe3+金屬離子對茶綠色素穩(wěn)定性影響較大。枇杷茶綠色素可用于非強(qiáng)堿性食品的著色加工，但是在生產(chǎn)或者儲存過程中應(yīng)避免與鐵質(zhì)容器接觸。此次試驗(yàn)為枇杷茶綠色素工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐與理論依據(jù)。