康婕，雷蘭蘭，舒靜，張曙東，馬倩雯

陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院（西安 710048）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），革蘭陽性菌代表，在自然界分布廣泛，是一種常見的食源性致病微生物，可引起化膿、乳腺炎、敗血癥和腦膜炎等疾病，會以各種方式侵害宿主細(xì)胞，使病情加重[1-6]。由于金黃色葡萄球菌代謝類型為需氧或兼性厭氧，對環(huán)境要求不高，能在各種惡劣環(huán)境中存活，并且能在適當(dāng)條件下產(chǎn)生腸毒素，引起的食物中毒，對人體健康危害較大[7-9]。近幾年，金黃色葡萄球菌引發(fā)的食物中毒報道層出不窮，其中不乏國內(nèi)知名企業(yè)，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒約占食源性微生物食物中毒事件的25%，金黃色葡萄球菌成為僅次于沙門菌和副溶血性弧菌的第三大微生物致病菌，不僅對人身體健康造成威脅，也給企業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失[10-13]。因此加強(qiáng)食品中金黃色葡萄球菌的監(jiān)管及檢測工作任重道遠(yuǎn)。同時，應(yīng)提高食品檢驗檢測機(jī)構(gòu)的整體水平，定量質(zhì)控菌株就是檢測機(jī)構(gòu)自檢自查自控、省級部門全面考核的重要工具，然而國內(nèi)外質(zhì)控樣品成本過高，無法滿足常態(tài)化考核，所以自主研制微生物定量菌株尤為重要。試驗以均勻性和穩(wěn)定性良好的金黃色葡萄球菌定量菌株質(zhì)控樣品的研制為目的，優(yōu)化設(shè)備條件，定制適用耗材，探究菌體制備最佳條件、各個環(huán)節(jié)致死率、儲存條件的驗證及均勻性和穩(wěn)定性的驗證，為標(biāo)準(zhǔn)定量菌株的研制提供依據(jù)[14-15]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌菌株ATCC 6538（美國模式菌種收集中心）。

脫脂乳（市售脫脂乳、經(jīng)檢驗不含目標(biāo)菌）；海藻糖；蔗糖；大豆蛋白；等。

TSB培養(yǎng)基；定值無菌加長具棉巴氏德管（細(xì)部15 cm）；血瓊脂平板（購自北京陸橋，貨號PB001，批號210602）；胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）（北京陸橋，貨號CM301，批號191106）。

1.1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3781L-PC型高壓蒸汽滅菌器[迪圖（上海）生物科技有限公司]；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)醫(yī)療設(shè)備廠）；BCD-539WT/WTY/WH型海爾宇航冰箱；CX41型生物顯微鏡（日本OLYMPUS）；BSD-100型振蕩培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)醫(yī)療設(shè)備廠）；VITEK2 compact型全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)；1300SERIESA2型二級生物安全柜、Epsilon 2-4LSCplus型真空冷凍干燥機(jī)（CHRIST德國）；GL-20G-II型冷凍離心機(jī)；氧氣瓶；火焰封口器；TDZ5-WS型臺式離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）定制凍干管（內(nèi)徑3 mm、長20 cm玻璃管）；EP管。

1.2 試驗方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌生長曲線的測定

將金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 6538從30%甘油管中轉(zhuǎn)種至血瓊脂平板上放置于生化培養(yǎng)箱，于36℃培養(yǎng)24 h。將血瓊脂平板上的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至50 mL的胰蛋白胨大豆肉湯（TSB），放置于振蕩培養(yǎng)箱以200 r/min的轉(zhuǎn)速搖瓶36 ℃連續(xù)培養(yǎng)，每隔2 h取菌液進(jìn)行吸光度的測定，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，600 nm處吸光度為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線，觀察對數(shù)期結(jié)束點作為收獲菌體的最佳時間。

1.2.2 凍干保護(hù)劑的選擇

為避免凍干過程對金黃色葡萄球的損傷，添加適量的保護(hù)劑可以提高菌體的存活率，其中棉子糖、蔗糖、乳糖、海藻糖等糖類和膠原蛋白、大豆蛋白、脫脂乳等蛋白質(zhì)類都是廣泛應(yīng)用的保護(hù)劑，抗壞血酸、磷酸鹽緩沖液、硫代硫酸鈉、羥胺、氨基酸、聚乙二醇、甘油、二甲基亞砜等都可以使菌體在冷凍環(huán)境中免受損害，糖類和蛋白質(zhì)類保護(hù)劑可在細(xì)胞表面形成黏性層，從而保護(hù)細(xì)胞[16]。海藻糖能夠在冷凍、干燥和貯藏過程中均有穩(wěn)定細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用，且玻璃化轉(zhuǎn)變溫度高，使冷凍干燥過程的基質(zhì)保持穩(wěn)定。蔗糖是一種雙糖，研究表明雙糖比其他糖類對細(xì)胞磷脂有更強(qiáng)的結(jié)合力，在干燥過程中能表現(xiàn)出耐受力，還能保護(hù)蛋白結(jié)構(gòu)。大豆蛋白作為蛋白類保護(hù)劑能在菌體細(xì)胞壁外形成保護(hù)膜，從而有效地保護(hù)菌體。本著保護(hù)效果好、成本較低的原則，選擇海藻糖、蔗糖和大豆蛋白作為保護(hù)劑進(jìn)行研究。

1.2.3 金黃色葡萄球菌質(zhì)控樣品制備流程

1.2.3.1 制備流程

制備流程如圖1所示。

圖1 金黃色葡萄球菌制備流程

1.2.3.2 制備要點

1.2.3.2.1 預(yù)處理定制凍干管預(yù)處理：用2%鹽酸浸泡過夜，自來水沖洗干凈后，用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后，加入脫脂棉塞后，在121 ℃下高壓滅菌15～20 min，備用。

無菌脫脂牛奶：如果是盒裝脫脂牛奶，應(yīng)進(jìn)行分裝滅菌115 ℃、20 min，或者30 g脫脂奶粉溶于200 mL蒸餾水中，滅菌115 ℃，15 min。

1.2.3.2.2 菌體制備

將1.2.1小節(jié)中培養(yǎng)至對數(shù)期的新鮮金黃色葡萄球菌菌液（培養(yǎng)物濃度以細(xì)胞或孢子不少于107為宜），測定600 nm處的吸光度，吸取10 mL菌液，按10 000 r/min離心5 min，棄上清液得到菌泥，使用PBS清洗后，按10 000 r/min再次離心5 min，得到的菌泥中采用無菌具塞巴氏毛細(xì)滴管加入10%無菌脫脂牛奶，在渦旋振蕩儀充分混勻，并加入復(fù)合保護(hù)劑，吸出分裝至凍干管（管外壁應(yīng)提前貼好標(biāo)簽注明菌株信息及保藏時間）。采用無菌具塞巴氏毛細(xì)滴管，直接滴入凍干管底部，注意不要濺污上部管壁，每管分裝量200 μL。分裝凍干管時間盡量要短，最好在1～2 h內(nèi)分裝完畢并預(yù)凍。分裝時應(yīng)注意在無菌條件下操作。

1.2.3.2.3 預(yù)凍

將分裝好菌液的西林瓶置于冷凍干燥機(jī)下層進(jìn)行預(yù)凍，預(yù)凍4 h以上，溫度達(dá)到-20～-50 ℃左右。

1.2.3.2.4 主干燥

在冷凍干燥機(jī)隔板內(nèi)開始冷凍干燥，時間一般為48 h，至完全干燥成粉末狀。

1.2.3.2.5 終末干燥

終末干燥階段隔板溫度回升，結(jié)束后得到白色疏松的凍干樣品。

終止干燥時間應(yīng)同時滿足幾種情況進(jìn)行判斷：西林瓶內(nèi)凍干物呈酥塊狀；松散片狀或者真空度接近空載時的最高值；樣品溫度與管外溫度接近。

1.2.3.2.6 真空封口及真空檢驗

在真空狀態(tài)下壓蓋，并使用高頻電火花真空測定儀測定真空度。

1.2.3.2.7 質(zhì)量檢查

冷凍干燥后抽取若干支凍干管進(jìn)行各項指標(biāo)檢查，如存活率、生產(chǎn)能力、形態(tài)變異、雜菌污染等。

1.2.3.2.8 保藏

西林瓶于-18 ℃冷凍保存。

1.2.4 樣品均勻性的測定

1.2.4.1 菌種的水化

成品樣品中金黃色葡萄球菌的數(shù)量以最終制成的樣品在經(jīng)40 mL無菌生理鹽水水化后，金黃色葡萄球菌濃度約104CFU/mL。

1.2.4.2 均勻性的測定

制備后的成品中隨機(jī)抽取10份，每瓶2個重復(fù)進(jìn)行均勻性測試，使用單因素方差分析中F檢驗對質(zhì)控樣品進(jìn)行均勻性檢驗。

1.2.5 樣品穩(wěn)定性的測定

穩(wěn)定性主要是考察質(zhì)控樣品長期和短期的穩(wěn)定性及模擬運輸條件下樣品的穩(wěn)定性。長期穩(wěn)定性試驗是通過均勻性檢驗的質(zhì)控樣品在-18 ℃條件下存放，分別存放0，7，14，21，30，60和180 d時隨機(jī)選取2瓶測定金黃色葡萄球菌的含量。短期穩(wěn)定性主要測定常溫，-4 ℃和-18 ℃儲存條件下隨機(jī)選取6瓶測定金黃色葡萄球菌的含量。模擬運輸條件下樣品的穩(wěn)定性主要是模擬快遞運輸環(huán)境，測定其菌體含量，用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌生長曲線的測定

微生物的生長曲線能體現(xiàn)出微生物不同生長階段的特征，為研究金黃色葡萄球菌的生長規(guī)律和確定最佳菌體收獲時間，以時間為橫坐標(biāo)，600 nm處吸光度為縱坐標(biāo)，繪制金黃色葡萄球菌的生長曲線。由圖2可以看出0～4 h為遲緩期，金黃色葡萄球菌生長速率常數(shù)為零代謝活力和耐受力不強(qiáng)，對不良環(huán)境的抵抗能力下降。從4 h開始進(jìn)入對數(shù)期，生長速率代謝旺盛，不過這個時間菌體比較敏感，不易冷凍干燥，從12 h開始進(jìn)入穩(wěn)定期，活細(xì)菌數(shù)保持相對穩(wěn)定，總細(xì)菌數(shù)達(dá)到細(xì)胞代謝產(chǎn)物積累達(dá)到峰，是生產(chǎn)的收獲期，所以試驗確定收獲時間為12 h，選取恒溫培養(yǎng)12 h的菌體作為后續(xù)冷凍干燥的對象。

圖2 金黃色葡萄球菌生長曲線

2.2 凍干劑的篩選和優(yōu)化

使用單因素分析法對金黃色葡萄球菌的凍干劑進(jìn)行篩選，從表1可知，利用三因素方差分析研究海藻糖、蔗糖和大豆蛋白對于試驗結(jié)果的影響關(guān)系，海藻糖呈現(xiàn)顯著性（F=12.551，P=0.019＜0.05），說明主效應(yīng)存在，海藻糖會對試驗結(jié)果產(chǎn)生差異關(guān)系。具體差異可通過方差分析進(jìn)行具體分析。蔗糖沒有呈現(xiàn)顯著性（F=0.062，P=0.941＞0.05），說明蔗糖并不會對試驗結(jié)果產(chǎn)生差異關(guān)系。大豆蛋白沒有呈現(xiàn)顯著性（F=0.062，P=0.941＞0.05），說明大豆蛋白并不會對試驗結(jié)果產(chǎn)生差異關(guān)系。

表1 凍干劑三因素方差分析結(jié)果

根據(jù)金黃色葡萄球菌的凍干劑正交試驗，最終選擇海藻糖添加量2%+蔗糖添加量6%+大豆蛋白添加量4%為金黃色球菌的復(fù)合凍干劑，保護(hù)率可達(dá)95.1%。

表2 凍干劑三因素正交試驗統(tǒng)計表 單位：%

2.3 均勻性測定

從制備好的3個濃度樣品中隨機(jī)取10瓶做均勻性檢驗，3個濃度樣品F值均小于臨界值F0.05(9,10)=3.02，這表明在0.05顯著性水平時，表明3個濃度質(zhì)控樣品組內(nèi)不存在顯著性差異，樣品均勻性良好。

表3 均勻性檢驗統(tǒng)計表

2.4 穩(wěn)定性檢測

對一批經(jīng)過均勻性驗證的質(zhì)控樣品A在0，7，14，21，30，60和180 d時隨機(jī)選取2瓶測定金黃色葡萄球菌的活菌數(shù)，試驗結(jié)果和統(tǒng)計結(jié)果見表4。由于|b1|＜t(0.95,5)×S(b1)，表明斜率不顯著，沒有觀察到不穩(wěn)定性，說明樣品在觀察的時間段內(nèi)穩(wěn)定。

表4 長期穩(wěn)定性檢驗統(tǒng)計表

將制備好的樣品A隨機(jī)抽取18瓶分別在常溫，-4℃和-18 ℃（每個溫度存放條件下6瓶）的條件下分別在0，1，2，3，4和5 d測定活菌數(shù)，采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表5。統(tǒng)計量|t|值小于臨界值t0.05(34)=2.04，表明制備的質(zhì)控樣品在5 d內(nèi)穩(wěn)定。

表5 短期穩(wěn)定性檢驗統(tǒng)計表

模擬運輸條件下樣品的穩(wěn)定性主要是模擬快遞運輸環(huán)境，測定其菌體含量，用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表6。統(tǒng)計量|t|值小于臨界值t0.05(34)=2.04，表明制備的質(zhì)控樣品在運輸過程中穩(wěn)定。

表6 運輸條件穩(wěn)定性檢驗統(tǒng)計表

3 結(jié)論

此研究建立了一種運用真空冷凍干燥技術(shù)制備均勻性穩(wěn)定性滿足要求的金黃色葡萄球菌質(zhì)控樣品并對性能進(jìn)行測試，篩選保護(hù)劑保證菌體存活率。質(zhì)控樣品可用于實驗室內(nèi)部控制、實驗室間比對及實驗室考核。