劉 躍, 劉 超, 張文昌

(1.北京信息科技大學(xué) 儀器科學(xué)與光電工程學(xué)院,北京 100192；2.中國科學(xué)院微電子研究所 微電子器件與集成技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100029)

0 引 言

紅細(xì)胞分布寬度(red blood cell distribution width,RDW)是紅細(xì)胞體積異質(zhì)性的表征參量,可以直接反映紅細(xì)胞體積統(tǒng)計(jì)學(xué)分布特性(變異系數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差等),是血常規(guī)重要的檢測指標(biāo)之一,對于多種疾病的診療及預(yù)后具有重要的臨床參考價(jià)值。國內(nèi)外大量研究表明,急慢性心力衰竭、心肌梗死、高血壓等心血管疾病會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞大小、形態(tài)和變性能力發(fā)生改變[1],心血管疾病的發(fā)病及預(yù)后與RDW呈現(xiàn)一定的相關(guān)性[2]。此外,RDW在風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、乙肝、惡性腫瘤性貧血、膽道狹窄、膿毒癥[1,3]、Ⅱ型糖尿病[4]等疾病的進(jìn)展及療效評估中也具有重要的參考價(jià)值。因此,對紅細(xì)胞體積進(jìn)行準(zhǔn)確檢測實(shí)現(xiàn)高分辨率RDW檢測及表征具有重要的臨床意義和應(yīng)用價(jià)值。

RDW的檢測及表征是基于大量紅細(xì)胞體積檢測結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,目前單細(xì)胞體積檢測方法主要包括流式細(xì)胞分析法和庫爾特電子體積法[5～7]。然而,典型激發(fā)光斑的光強(qiáng)具有高斯分布特性,細(xì)胞流經(jīng)激發(fā)光斑的位置具有一定的隨機(jī)性,從而導(dǎo)致前向散射光檢測方法易受隨機(jī)誤差的影響。另一方面,庫爾特電子體積法由于檢測孔附近電場分布不均勻,細(xì)胞流經(jīng)檢測區(qū)域引起的電流變化同樣存在一定的隨機(jī)誤差。

為了減小隨機(jī)誤差的影響,國內(nèi)外多個(gè)課題組依托于微流控芯片流道尺寸與細(xì)胞粒徑高度適配的特性,對基于微流控技術(shù)的細(xì)胞體積檢測方法開展了大量的研究。Riordon J等人[8]提出了一種帶有氣動(dòng)閥的微流控細(xì)胞體積檢測方法,通過控制閥腔對檢測通道高度進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)控減小細(xì)胞位置偏差；Sun T等人[9]對雙電極測得的差分信號的時(shí)間相關(guān)特性進(jìn)行了分析,實(shí)現(xiàn)了信號的高信噪比提??；Emaminejad S等人[10]基于多電極的差分輸出信號進(jìn)行分析,并分別利用3種參數(shù)對細(xì)胞粒徑實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確表征；文獻(xiàn)[10]利用多對楔形結(jié)構(gòu)電極對脈沖信號進(jìn)行調(diào)制,實(shí)現(xiàn)了微流道內(nèi)細(xì)胞位置的判定與誤差校正；Errico V等人[11]利用1個(gè)激勵(lì)電極、2個(gè)感應(yīng)電極進(jìn)行單細(xì)胞檢測,通過對2路輸出信號做差分運(yùn)算得到的正負(fù)峰值間的時(shí)延量進(jìn)行位置影響修正。以上方法充分顯示了微流控技術(shù)在單細(xì)胞特性分析方面的獨(dú)特優(yōu)勢,在一定程度上解決了細(xì)胞位置引起的隨機(jī)誤差影響。然而,多電極結(jié)構(gòu)微流控芯片制備過程繁瑣,對齊鍵合工藝難度較大,芯片之間檢測結(jié)果重復(fù)性較差。另外,基于信號強(qiáng)度表征的細(xì)胞體積統(tǒng)計(jì)分析方法依賴于時(shí)域信號(前向散射光強(qiáng)度、電流)的檢測準(zhǔn)確率,系統(tǒng)魯棒性較差。

針對以上問題,本文基于庫爾特電子體積檢測方法,提出了一種結(jié)合微流控技術(shù)與多級互相關(guān)分析(multiple cross-correlated analysis,MCCA)的高分辨率細(xì)胞體積檢測及表征方法。利用多級檢測微流道結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的多次、順序、獨(dú)立檢測,減小隨機(jī)誤差的影響。結(jié)合MCCA對多級脈沖信號進(jìn)行時(shí)間相關(guān)特性分析,獲取互相關(guān)系數(shù)峰值作為統(tǒng)計(jì)分析參量,提高體積分辨率,減小體積相近細(xì)胞的分布重疊率。最后,以3 μm聚苯乙烯微球(3 μm)、健康人紅細(xì)胞(RBCs)和Ⅱ型糖尿病人紅細(xì)胞(DM-RBCs,RDW增大)為檢測樣本,分別進(jìn)行單樣本標(biāo)定和混合樣本(3 μm+RBCs、3 μm+DM-RBCs)重疊率減低驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),對高分辨率RDW檢測及表征方法的有效性進(jìn)行驗(yàn)證。

1 高分辨率RDW檢測與表征原理

1.1 多級脈沖信號獲取與MCCA

氣動(dòng)進(jìn)樣單細(xì)胞多級檢測的原理示意如圖1(a)所示,鞘液與樣本液在壓力源的驅(qū)動(dòng)下在微流道內(nèi)形成層流,利用流體動(dòng)力學(xué)聚焦作用把細(xì)胞位置限定在一定的范圍內(nèi)減小位置偏差的影響,并利用置于檢測區(qū)域的兩側(cè)1對Ag/AgCl電極,對細(xì)胞流經(jīng)檢測孔時(shí)的電流變化量進(jìn)行檢測。多級檢測孔由大尺寸緩沖區(qū)分隔,多級檢測為相互獨(dú)立,細(xì)胞流經(jīng)檢測孔位置保持隨機(jī)性。

圖1 高分辨率RDW檢測與表征原理示意

假定微流控芯片具有n級檢測孔,當(dāng)單細(xì)胞流經(jīng)檢測區(qū)域時(shí),會(huì)產(chǎn)生n個(gè)帶有直流基線IDC的電流變化脈沖fi(t)(i=1,2,…,n),如圖2所示。利用高斯函數(shù)建模,可表示為

圖2 多重互相關(guān)分析示意

(1)

式中 ΔIi(i=1,2,…,n)為常數(shù),表示當(dāng)前脈沖峰值的幅值,A；σ為脈沖寬度,s；τi-1為f1(t)與fi(t)間的時(shí)間延遲,s。

相對于系統(tǒng)噪聲等隨機(jī)性干擾信號,多脈沖電流信號具有時(shí)間相關(guān)特性,利用互相關(guān)分析方法可以有效提高信噪比,減小干擾影響。假設(shè)細(xì)胞流動(dòng)速度恒定,n個(gè)脈沖的峰值相等(ΔI1=ΔI2=,…,=ΔIn),對互相關(guān)函數(shù)M進(jìn)行推導(dǎo)可得[12]

(2)

1.2 重疊率降低原理

(3)

對于包含多種粒徑細(xì)胞的混合樣本,以ΔI為參量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析時(shí),體積相近的細(xì)胞會(huì)由于檢測偏差產(chǎn)生分布重疊,如圖3所示,以M為表征參量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析可以有效減小重疊率,即MCCA算法可以有效提高細(xì)胞體積分辨能力。

圖3 重疊率降低示意

2 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析

基于以上理論分析,對微流控芯片檢測孔級數(shù)對重疊率的降低效果進(jìn)行了仿真分析,確定實(shí)驗(yàn)所需檢測級數(shù)為n=5。(重疊率小于0.2 %)。搭建了多級互相關(guān)RDW高分辨率檢測系統(tǒng),并以3 μm、RBCs、DM-RBCs為檢測樣本,分別進(jìn)行了單樣本標(biāo)定實(shí)驗(yàn)以及混合樣本(3 μm+RBCs、3 μm+DM-RBCs)重疊率降低驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2.1 系統(tǒng)搭建與樣品制備

實(shí)驗(yàn)采用PDMS+玻璃結(jié)構(gòu)的微流控芯片,制備過程主要包括芯片設(shè)計(jì)與掩模版制備、SU8模具制備、PDMS澆筑倒模以及PDMS與玻片不可逆鍵合4個(gè)過程。經(jīng)過2層光刻制備的微流控芯片流道具有2種深度:檢測孔深度約6 μm,緩沖區(qū)深度約12 μm,微流道其他區(qū)域的深度與緩沖區(qū)的深度相同。綜合考慮系統(tǒng)信噪比以及堵塞概率,最終確定檢測孔寬度為6 μm,如圖1(b)所示。

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)包括標(biāo)定實(shí)驗(yàn)和混合實(shí)驗(yàn)兩部分,為減小微球聚集,達(dá)到理想的單分散效果,含有3 μm微球的樣本中均添加0.1 %的Tween—20溶液,并超聲振蕩1 min。單顆粒標(biāo)定樣本:分別將15 μL 3 μm微球、RBCs、DM-RBCs與3 mLPBS混合,制備單顆粒樣本懸浮液；混合樣本:將15 μL 3 μm微球、15 μL RBCs與3 mL PBS混合,制備3 μm+RBCs的混合懸浮液；將15 μL 3 μm微球和15 μL DM-RBCs與3 mL PBS混合制備3 μm+DM-RBCs混合懸浮液。

通過Ag/AgCl電極施加在微流道兩端的直流激勵(lì)信號幅值約為200 mV；樣本液與鞘液的壓力源氣動(dòng)進(jìn)樣壓力為0.3～0.5 psi(1 psi=6.895 kPa)；利用DHPCA—100電流放大器(Femto,德國)對流道內(nèi)電流信號進(jìn)行檢測(增益106)及I/V轉(zhuǎn)換；輸出信號經(jīng)NI PCI—6363(16 bit,100 kHz)采集后利用MATLAB進(jìn)行離線分析。

2.2 單顆粒樣本標(biāo)定結(jié)果分析

由庫爾特電子體積檢測原理可知,細(xì)胞流過檢測孔產(chǎn)生的電流下降幅值與細(xì)胞/檢測孔的相對體積比例成正比。利用不同尺寸的微流道結(jié)構(gòu)對同一樣本的檢測結(jié)果存在一定的偏差。因此,需要分別對3 μm微球、RBCs及DM-RBCs進(jìn)行單顆粒樣本標(biāo)定實(shí)驗(yàn)。僅限于本文微流道尺寸結(jié)構(gòu)及檢測系統(tǒng),3 μm微球、RBCs及DM-RBCs的單顆粒樣本標(biāo)定結(jié)果如圖4所示。

圖4 單顆粒樣本標(biāo)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

其中,圖4(a),(e),(i)分別為10.5 s內(nèi)3 μm微球、RBCs及DM-RBCs流經(jīng)檢測區(qū)域的電流變化曲線；圖4(b),(f),(j)分別為單個(gè)3 μm微球、RBCs及DM-RBCs流經(jīng)檢測區(qū)域產(chǎn)生的5級電流脈沖曲線。由電流脈沖曲線可知,單顆粒經(jīng)過5級檢測孔時(shí)脈沖峰值ΔI具有一定的偏差,并且不具有特定的變化規(guī)律,在一定程度上表明了對單細(xì)胞進(jìn)行多次檢測的必要性。圖4(c),(d)為4 805個(gè)3 μm微球的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果:以ΔI為表征參量,ΔI的分布范圍為0.48～3.59 nA,平均值為1.88 nA,標(biāo)準(zhǔn)差為0.48 nA；以M為表征參量,分布范圍為109.72～1010.42。圖4(g),(h)為10 863個(gè)RBCs的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果:以ΔI為表征參量,ΔI的分布范圍為2.69～15.00 nA,平均值為8.28 nA,標(biāo)準(zhǔn)差為1.96 nA；以M為表征參量,分布范圍為1010.37～1011.02。圖4(k),(l)為7 825個(gè)DM-RBCs的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果:以ΔI為表征參量,ΔI的分布范圍為2.21～24.32 nA,平均值為10.91 nA,標(biāo)準(zhǔn)差為2.61 nA；以M為表征參量,分布范圍為1010.28～1011.42。利用該標(biāo)定實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果,可以實(shí)現(xiàn)后續(xù)混合樣本實(shí)驗(yàn)重疊界限以及重疊率的計(jì)算。

2.3 混合樣本檢測結(jié)果分析

在此基礎(chǔ)上,以3 μm微球作為參考顆粒,分別進(jìn)行3 μm+RBCs和3 μm+DM-RBCs混合樣本實(shí)驗(yàn),對基于MCCA方法的RDW高體積分辨率檢測及表征方法的可行性進(jìn)行驗(yàn)證?；旌蠘颖?3 μm+RBCs、3 μm+DM-RBCs)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 混合樣本實(shí)驗(yàn)結(jié)果

其中,圖5(a),(e)分別為7.5s內(nèi)3 μm+RBCs樣本及3 μm+DM-RBCs樣本流經(jīng)檢測區(qū)域的電流變化曲線；圖5(b),(f)分別為相應(yīng)的局部放大5級電流脈沖曲線。圖5(c),(d)為15 602個(gè)3 μm+RBCs的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果:以ΔI為表征參量,重疊區(qū)間[2.69,3.59]nA的重疊率為3.22 %；以M為表征參量,重疊區(qū)間[1010.37,1010.42]的重疊率降至0.72 %。圖5(g),(h)為2 698個(gè)3 μm+DM-RBCs的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果:以ΔI為表征參量,重疊區(qū)間[2.21,3.59]nA的重疊率為12.08 %；以M為表征參量,重疊區(qū)間[1010.28,1010.42]的重疊率降至1.93 %。

3 結(jié) 論

本文結(jié)合微流控技術(shù)與多級互相關(guān)分析算法提出一種RDW高分辨率檢測及表征方法。利用具有多級檢測孔的微流控芯片對單細(xì)胞進(jìn)行順序多次檢測,得到具有時(shí)間相關(guān)特性的多脈沖電流信號,減小單次檢測隨機(jī)誤差的影響。利用MCCA算法對時(shí)域信號進(jìn)行多級互相關(guān)分析,并以最大相關(guān)系數(shù)為表征參量對統(tǒng)計(jì)分布特性進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：相比于傳統(tǒng)基于單次檢測和以峰值為表征參量的統(tǒng)計(jì)分析方法,基于MCCA的RDW檢測及表征方法可以有效提高顆粒體積分辨能力,降低重疊率。本文方法可以廣泛推廣到其他特征參量的單微粒表征及計(jì)數(shù)方面的研究。