郭茂，黃冰冰，李林海，林思榮，黃鳴清，倪林

(1.福建省食品藥品質(zhì)量檢驗研究院，福建 福州 350012；2.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院，福建 福州 350002；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)，藥學(xué)院，福建 福州 350122)

香樟(Cinnamomumcamphoravar.linalooliferaFujita)為樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)常綠喬木植物[1]，是我國亞熱帶常綠闊葉林的主要樹種之一[2]，福建、臺灣、江西、廣東等地區(qū)均有分布[3]。福建林地水肥等條件適宜香樟生長，良種已全覆蓋，成為香樟精油的主產(chǎn)區(qū)。香樟枝葉用于精油提取后，大量枝葉殘渣被廢棄，植物資源利用率低[2]、嚴(yán)重污染環(huán)境，已成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟需解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。課題組致力于香樟資源的開發(fā)與利用研究，前期從枝葉提取物中分離、純化和鑒定化合物20余個[4]，其中兩個雙四氫呋喃木脂素類化合物，即芝麻素和9-羥基芝麻素含量大，具有良好的抗菌[5]、抗癌[6]、抗氧化[7]、抗炎[8]、降血壓[9]、降低膽固醇[10]、保肝[11]等功效，可用于農(nóng)藥增效劑、食品、保健產(chǎn)品添加劑等[12]，市場前景廣闊。因此，本文構(gòu)建了高效液相色譜(HPLC)法同時測定芝麻素和9-羥基芝麻素含量的方法，并對不同產(chǎn)地香樟原料進行測定，為香樟植物資源化學(xué)利用、開發(fā)芝麻素和9-羥基芝麻素制備工藝、產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等奠定基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 藥材、試劑與儀器 香樟樣品于2021年5月在福建泉州市安溪半林國有林場(北緯24°56′55″，東經(jīng)117°59′36″，海拔728 m)和福建泉州市南安向陽鄉(xiāng)海山果林場(北緯25°17′38″，東經(jīng)118°31′10″，海拔700 m)采集，經(jīng)福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院倪林博士鑒定為樟科樟屬樟(C.camphora)，從其樟油化學(xué)成分看，應(yīng)為香樟(C.camphoravar.linalooliferaFujita)，品系有“南安1號”和“牡丹1號”。植物枝葉標(biāo)本存放于福建農(nóng)林大學(xué)自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心樣品室。

Diamonsil C18分析型反相色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)(北京迪馬科技有限公司)；分析純乙酸乙酯、甲醇等(北京化工廠)；色譜級甲醇、乙腈(德國Merck公司)；水為超純水。芝麻素和9-羥基芝麻素的對照品為實驗室自制，經(jīng)ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR測定，數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]對照一致，HPLC測定化合物純度，歸一化法計算質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%以上。

Waters W2695-QDA高效液相色譜儀(美國Waters公司)；PR224ZH/E型電子分析天平(美國OHAUS公司)；Millipore超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；KQ50ODE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TQ-400Y 高速多功能粉碎機(永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司)。

1.2 溶液的配制

1.2.1 混合對照品溶液制備 分別取適量的芝麻素和9-羥基芝麻素對照品，精密稱定，加入適量乙酸乙酯稀釋定容至5 mL，制得對照品儲存溶液。分別量取1.0 mL對照品儲存溶液混合，即得芝麻素濃度為1.08 mg·mL-1、9-羥基芝麻素濃度為1.23 mg·mL-1的混合對照品溶液；再分別準(zhǔn)確量取0.4 mL對照品儲存溶液混合，即得芝麻素濃度為0.08 mg·mL-1、9-羥基芝麻素濃度為0.08 mg·mL-1的混合對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液制備 取適量陰干香樟樣品，粉碎，稱取2.0 g，置250 mL圓底燒瓶中，加入50 mL乙酸乙酯，稱總重，在加熱套中回流提取1 h，冷卻后補足差重，濾過，精密吸取4 mL置蒸發(fā)皿中，將溶劑吹干，殘渣加甲醇適量使溶解，并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，定容，即得。

1.3 HPLC測定含量方法的構(gòu)建

1.3.1 色譜條件 采用Dikma Diamonsil C18分析型反相色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，以乙腈(A)-水(B)為流動相，梯度洗脫(0～30 min,30% A → 42% A;30～45 min,42% A → 65% A)，流速1.0 mL·min-1,檢測波長為235 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

1.3.2 系統(tǒng)適用性實驗 按照“1.3.1”項下色譜條件，分別取“1.2.1”項下配備的混合對照品溶液與“1.2.2”項下配備的供試品溶液進樣10 μL，記錄色譜圖。

1.3.3 線性關(guān)系考察 在“1.3.1”項下的色譜條件下，取“1.2.1”項下芝麻素濃度為0.08 mg·mL-1、9-羥基芝麻素濃度為0.08 mg·mL-1的混合對照品溶液分別進樣1、6、10、20 μL，取“1.2.2”項下芝麻素濃度為1.08 mg·mL-1、9-羥基芝麻素濃度為1.23 mg·mL-1的混合對照品溶液分別進樣2、4、6、8、10 μL，測定峰面積；以峰面積為縱坐標(biāo)，分別以對照品的2個含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 精密度試驗 在“1.3.1”項下的色譜條件下，將“1.2.2”項下制備的混合供試品溶液連續(xù)吸取進樣6次，每次進樣10 μL，測定，分別記錄下芝麻素和9-羥基芝麻素的峰面積積分值，由此計算出兩個化合物的RSD。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗 在“1.3.1”項下的色譜條件下，將“1.2.2”項下制備的混合供試品溶液室溫放置0、2、4、8、12、24 h，分別進樣10 μL，測定，分別記錄下芝麻素和9-羥基芝麻素的峰面積積分值，由此計算出兩個化合物的RSD。

1.3.6 重復(fù)性試驗 取同一批香樟樣品6份，按“1.2.2”項下的方法分別制備6份供試品溶液，在“1.3.1”項下的色譜條件下分別測定，記錄芝麻素和9-羥基芝麻素的峰面積，計算相應(yīng)的RSD。

1.3.7 加樣回收率試驗 精密稱取6份已知含量的香樟粉末，分別加入適量的混合對照品溶液，于“1.3.1”項下的色譜條件下測定，記錄芝麻素和9-羥基芝麻素的峰面積，計算加樣回收率。

1.3.8 含量測定 取香樟樣品，按“1.2.2”項下方法操作，并在“1.3.1”項下色譜條件下通過HPLC測定，以外標(biāo)法計算樣品中芝麻素和9-羥基芝麻素的含量。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析 利用Excel 2016和SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品與對照品的HPLC分析 混合對照品和供試品的HPLC色譜見圖1。在235 nm檢測波長下，混合對照品和供試品兩者的芝麻素和9-羥基芝麻素分離度均大于1.5，實現(xiàn)完全分離，保留時間分別為30.488和43.624 min，即“1.3.1” 項下色譜條件方法可用于香樟中芝麻素和9-羥基芝麻素的含量測定。

A.對照品；B.樣品 1.芝麻素;2.9-羥基芝麻素

2.2 考察結(jié)果 對照品的線性回歸方程、線性范圍結(jié)果見表1。

表1 對照品的線性回歸方程、線性范圍

數(shù)據(jù)結(jié)果表明，芝麻素和9-羥基芝麻素在0.1～10 μg范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系；精密度試驗的RSD分別為0.29%和0.28%，表明該方法精密度良好，符合精密度考察要求；穩(wěn)定性試驗的RSD分別為0.88%和0.67%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；重復(fù)性試驗的RSD分別為0.55%和0.48%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3 加樣回收率試驗 加樣回收率試驗結(jié)果如表2所示。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果

由加樣回收率試驗結(jié)果可以看出，兩個芝麻素類成分的平均加樣回收率分別為97.5%(RSD=0.77%)和98.4%(RSD=0.82%)，RSD均小于3%，表明該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于不同香樟植物原料中芝麻素類成分的測定。

2.4 含量測定 香樟樣品含量測定結(jié)果見表3～6。

表3 不同坡位的樣品中芝麻素和9-羥基芝麻素測定結(jié)果(mg·g-1,n=3)

香樟不同組織部位(枝條、葉片)中芝麻素類含量存在差異。3個不同采集地點的樣品中芝麻素和9-羥基芝麻素含量均表現(xiàn)為香樟葉片中最高，且香樟葉片中的芝麻素類含量遠(yuǎn)高于枝條中含量，其中不同香樟組織部位的芝麻素類含量表現(xiàn)為：嫩葉>老葉>嫩枝>老枝，香樟嫩葉中的芝麻素和9-羥基芝麻素含量分別是老葉中含量的2倍和1.5倍。采集自不同坡位(上坡段、中坡段和下坡段)的3個香樟樣品中芝麻素類含量存在差異。坡位對其含量具有顯著影響，3個坡位的芝麻素類均含量表現(xiàn)為：上坡段>中坡段>下坡段。另外，對比“南安1號”和“牡丹1號”兩個品系，枝條和葉片中芝麻素類的含量均為“南安1號”品系最高。據(jù)已有文獻(xiàn)報道，香樟葉中芝麻素含量是芝麻的1～3倍[13-14]，是細(xì)辛的2～4倍[15]，是紫珠葉的10～22倍[16]，是兩面針的23～48倍[17]，且香樟葉中含量最高的化合物9-羥基芝麻素，其含量遠(yuǎn)高于馬鞭草、黃毛豆腐柴、石榴等植物[18-19]。

表4 不同品系樣品中芝麻素和9-羥基芝麻素測定結(jié)果(mg·g-1,n=3)

表5 不同香樟組織部位中芝麻素和9-羥基芝麻素測定結(jié)果(mg·g-1,n=3)

表6 品系、坡位和香樟組織部位對芝麻素含量和9-羥基芝麻素含量的主體間效應(yīng)檢驗

通過多元方差分析，3個主效應(yīng)(品系、坡位與香樟組織部位)的4種檢驗統(tǒng)計量均小于顯著性水平0.05，說明三因素分別對兩個成分含量有顯著影響;“品系＊坡位＊香樟組織部位”的4種檢驗統(tǒng)計量均小于顯著性水平0.05，說明三因素交互共同對兩個成分含量的影響存在協(xié)同作用。通過兩個因變量(芝麻素和9-羥基芝麻素含量)在三因素上的差異分析，兩個成分含量在三因素的顯著性均為0.000(<0.05)，說明兩個成分含量在3個因素上都存在顯著差異。兩個成分含量在“品系＊坡位＊香樟樹組織部位”上的顯著性分別為0.000(<0.05)和0.002(<0.05)，所以，三因素的交互作用在兩個成分含量上均存在顯著差異。

香樟中芝麻素類成分的合成和積累會受到不同品系、不同種植坡位和不同組織部位的影響。種植于不同坡位的香樟，其生長環(huán)境有所不同，不同坡位的光照、土壤條件、水分和肥力等均有差異，且香樟嫩葉和嫩枝部位的光照條件優(yōu)于老葉和老枝，葉片受光面積大于枝條，明顯種植在上坡位的香樟中芝麻素類成分含量最高。因此，光照、土壤、水分和肥力等環(huán)境條件對香樟中的芝麻素類成分的合成和積累會造成很大的影響。故在上坡位的環(huán)境下種植“南安1號”品系的香樟，在此條件下更有利于芝麻素類成分的合成和積累。香樟資源豐富，開發(fā)利用潛力較大，今后可著重利用“南安1號”品系香樟的葉片生產(chǎn)芝麻素系列產(chǎn)品，可替代芝麻成為新資源，彌補香樟植物資源利用不足問題，開發(fā)高附加值化學(xué)產(chǎn)品，有效延伸香樟產(chǎn)業(yè)鏈。

3 結(jié)論

3.1 建立了HPLC測定香樟中兩個芝麻素類成分含量的方法，該方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，各項方法學(xué)考察結(jié)果符合有關(guān)規(guī)定，為香樟的資源開發(fā)利用和質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

3.2 種植上坡位的“南安1號”品系香樟的嫩葉中芝麻素類成分含量最高，芝麻素可達(dá)(2.596±0.27)mg·g-1，9-羥基芝麻素可達(dá)(4.171±0.21)mg·g-1。

3.3 不同品系、坡位及香樟組織部位對香樟中芝麻素類成分的含量具有協(xié)同作用，且對香樟中芝麻素類成分的合成和積累具有顯著影響。

3.4 香樟中芝麻素類成分的合成和積累會受到光照、土壤、水分和肥力等不同環(huán)境因素的影響。