毛桑隱　汪麗霞　宋劍鋒　劉勝軍　王淪　徐強

關鍵詞：常山胡柚；酸橙；基因組分析；分子標記；果實品質

中圖分類號：S666.3 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）01-0025-10

常山胡柚（Citrus aurantium'Changshan Hu you）也叫常山柚橙、金柚、衢枳殼，是我國地方特色柑橘資源，主產(chǎn)區(qū)為浙江省衢州市常山縣。據(jù)資料記載，常山胡柚已有上百年的栽培歷史，最早在常山縣青石鎮(zhèn)底鋪村和澄潭村栽培。目前，青石鎮(zhèn)澄潭村胡家自然村還保存一棵樹齡超過百年的實生胡柚樹，如今栽培的常山胡柚大多源自這棵常山胡柚“祖宗樹”。常山胡柚現(xiàn)已成為常山縣特色農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)，是當?shù)毓r(nóng)的重要收入來源。

有關常山胡柚的遺傳背景，前人有不少研究。蔣柏宏通過分析胡柚的植物學性狀，推測常山胡柚可能是柚和其他柑橘屬的天然雜交種。蔡劍華等通過過氧化物同工酶酶譜法分析，發(fā)現(xiàn)常山胡柚有7條過氧化物同工酶酶譜帶，而柚的5條酶譜帶與常山胡柚其中5條完全一致，多余的2條正好與甜橙相吻合，表明常山胡柚可能是柚和甜橙雜交而來。陳力耕等利用RAPD分子標記技術對常山胡柚、椏柑、甜橙、衢橘和柚進行分子鑒定，推測常山胡柚可能是先由柚與椏柑或衢橘自然雜交，再與甜橙自然雜交而得到的天然雜種。陳士超等采用RAPD和ISSR分子標記技術對常山胡柚和常山當?shù)馗涕儋Y源進行鑒定，結果表明常山胡柚可能是由柚、甜橙和其他柑橘屬資源通過多重雜交而來。Xu等通過對常山胡柚的可能親本材料進行ITS序列分析，發(fā)現(xiàn)常山胡柚有2個不同序列的ITS1，其中ITSIA序列與柚完全一致，ITSIB序列與酸橙完全一致，推測常山胡柚是由柚與酸橙雜交而來。上述通過不同手段對常山胡柚的遺傳背景進行了研究報道，然而對其遺傳上的鑒定卻報道較少。

隨著現(xiàn)代測序技術的迅速發(fā)展，通過全基因組信息可以全面而準確地鑒定材料之間的變異。Xu等完成對二倍體甜橙的測序組裝，揭示了二倍體甜橙是柚與橘雜交2次產(chǎn)生的雜種后代。Wu等完成對克里曼丁橘的測序，揭示了柑橘的馴化史和柑橘起源。前人完成了高質量柚、野橘、甜橙以及野生柑橘資源的基因組測序，為進行資源鑒定提供了豐富的基因組信息。

研究基于全基因組重測序信息，結合分子標記與橘、酸橙、葡萄柚、柚形態(tài)特征和品質性狀對常山胡柚進行遺傳鑒定，結果顯示常山胡柚全基因組具有酸橙遺傳背景，形態(tài)學特征與酸橙相似，果實品質較酸橙有明顯改良，推測是一種品質改良的酸橙。可為進一步對常山胡柚的遺傳背景分析和種質資源的保護利用提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗材料

常山胡柚于2020年7月采樣自浙江省衢州市常山縣青石鎮(zhèn)澄潭村。其他供試材料包括典型的柑橘資源與浙江地區(qū)的地方性橘、柚和酸橙等柑橘資源，具體詳見表1。

1.2形態(tài)學觀測

比較橘、酸橙、常山胡柚、葡萄柚和柚葉片與果實形態(tài)學上的差異。選擇發(fā)育正常樹體的中上部枝條，取完整的成熟葉片進行拍照比較，利用游標卡尺測量葉片長度和寬度，并計算葉形指數(shù)，記錄翼葉，通過IBM SPSS Statistics 20軟件用于顯著性差異分析。同樣在果實成熟期選擇完整果實進行拍照，比較不同柑橘類果實正面與果實切面。

1.3果實品質測定

選取橘、酸橙、常山胡柚、葡萄柚和柚的成熟果實進行品質測定，通過游標卡尺測量果實橫徑、縱徑，并計算果形指數(shù)；采用電子天平測定果實單果質量、果皮質量、果渣質量、種子質量等指標，并計算可食率；采用手持糖酸儀測定可溶性固形物和可滴定酸，計算果實固酸比；2，6-二氯酚靛酚試劑測定抗壞血酸含量。最后通過IBM SPSS Statistics 20軟件用于顯著性差異分析。

1.4全基因組重測序分析

取常山胡柚新鮮葉片于研缽中使用液氮對其進行充分研磨，將研磨好的凍樣送測序公司（北京諾禾致源科技股份有限公司）進行全基因組重測序，測序深度25.7層，共獲得17.5G數(shù)據(jù)量。以甜橙作為參考基因組，通過BWA軟件將重測序數(shù)據(jù)比對到甜橙參考基因組，使用gatk4.0進行SNP-calling，最終獲得常山胡柚與橘、酸橙、葡萄柚和柚的SNP數(shù)據(jù)。利用本實驗室前期已獲得的可區(qū)分柑橘幾大基本種的診斷型SNP位點，對常山胡柚與橘、酸橙、葡萄柚和柚基因組以200kb為窗口、100kb為步長進行滑動，將全基因組劃分為3390個區(qū)域，并對每一個窗口內(nèi)的SNP信息進行統(tǒng)計分析用以判斷每個窗口的遺傳來源，獲得各自全基因組的遺傳成分圖，并基于群體重測序鑒定到的高質量SNP及甜橙基因組鑒定到的4dTV位點，最終使用131387個4dTV位點構建聚類樹。

1.5 DNA提取及InDel分子標記開發(fā)

通過CTAB法對柑橘葉片進行DNA提取。利用SNP-calling后的InDel數(shù)據(jù)尋找橘、柚、常山胡柚、酸橙和葡萄柚基因組差異信息，開發(fā)特異性In-Del分子標記，經(jīng)過多對引物篩選確定了4對InDel引物可用于驗證橘、柚、常山胡柚、酸橙和葡萄柚之間的遺傳差異（由武漢擎科生物公司合成），其InDel變異位點位于2號染色體和7號染色體上不同位點，引物序列詳見表2。PCR擴增使用高保真酶（Phan-to Max Super-Fidelity DNA Polymerase）進行，反應體系為20μL，各組分為2×phanta Max Buffer 10μL，Phanta Max 0.4μL，dNTP Mix 0.4μL，F(xiàn)orward prim-er 0.5μL，Reverse primer 0.5μL，DNA原液1μL（150 ng左右），ddH20 7.2μL。在Tl00 Thermal Cy-cler型號PCR儀中進行擴增，PCR擴增反應條件為預變性95℃3 min，變性95℃15 s，退火54℃15 s，延伸72℃40 s，35個循環(huán)，終延伸72℃5 min。PCR擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，電泳檢測條件為恒定電壓120 V、電流400 mA、額定功率100 W，電泳20 min，之后在Universal Hood II儀器中檢測PCR產(chǎn)物。

2結果與分析

2.1葉、果形態(tài)學分析

通過對本地早橘、秭歸酸橙、常山胡柚、星路比葡萄柚和四季柚的葉片和果實進行觀察（圖1），不同柑橘資源的葉形差異較大，常山胡柚的葉片形態(tài)與酸橙相近，接近卵圓形或卵形，且翼葉較小，而柚翼葉較大。常山胡柚屬于中小果型，大小與酸橙相似，果皮金黃色，果肉呈淡黃色，果皮厚度與酸橙相近。另從葉形指數(shù)可以看出常山胡柚與秭歸酸橙差異不顯著，而與本地早橘、星路比葡萄柚和四季柚差異顯著（表3）。

2.2不同柑橘資源常規(guī)品質分析

選取本地早橘、秭歸酸橙、星路比葡萄柚和琯溪蜜柚等典型柑橘品種與常山胡柚進行果實品質分析。由表4可知，不同柑橘種類的內(nèi)外品質存在差異，常山胡柚在單果質量、果皮厚度、種子質量和果皮質量等外觀品質指標上與酸橙無顯著差異，與橘、葡萄柚和柚存在顯著差異。而常山胡柚在可滴定酸和固酸比等內(nèi)在品質指標上與酸橙存在顯著差異，其可滴定酸平均含量為0.98%，固酸比平均可達12.30，相較酸橙而言內(nèi)在品質有明顯改良。

2.3胡柚全基因組分析

通過分析全基因組重測序數(shù)據(jù)，利用本實驗室前期開發(fā)的柑橘基因組數(shù)據(jù)庫，鑒定橘、常山胡柚、酸橙、葡萄柚和柚的遺傳組成，結果顯示常山胡柚全基因組超過87.91%的遺傳組分為柚橘雜合，柚純合的遺傳組分占9.77%（圖2）。通過與其他供試柑橘材料的全基因組結構進行比較，發(fā)現(xiàn)常山胡柚與酸橙的基因組結構最為相似（圖3），其中與江津酸橙的基因組結構相似度最高，達到了88.34%。通過常山胡柚與其他柑橘材料進行聚類，顯示常山胡柚與酸橙聚類在一起（圖4），綜上表明常山胡柚是一種酸橙。

2.4分子標記驗證

通過前期分子標記的開發(fā)，在全基因組不同變異位點上篩選到4對InDel引物可用于鑒定橘、柚、常山胡柚、酸橙與葡萄柚之間的遺傳差異。結果如圖5所示，橘為1條長帶，柚和葡萄柚為1條短帶，酸橙為柚和橘的2條帶，常山胡柚擴增的條帶大小與酸橙條帶相符，為柚和橘的2條帶，與柚和葡萄柚不符，故推測常山胡柚的親緣關系與酸橙相近。

3討論

筆者在本研究中基于全基因組重測序技術，結合形態(tài)學與果實品質分析，發(fā)現(xiàn)常山胡柚全基因組信息表現(xiàn)為酸橙的特征，葉形態(tài)和果實大小與酸橙相似，分子標記也印證與酸橙親緣關系較近，表明常山胡柚是一種酸橙，且常山胡柚果實品質優(yōu)于普通酸橙，其可滴定酸含量顯著低于酸橙，是一種品質得到改良的酸橙，推測其在栽培過程中逐漸馴化為一種低酸類型的酸橙。

近年來，隨著測序技術的快速發(fā)展，全基因組序列為進一步探索物種進化和資源鑒定提供了更為全面的信息。筆者通過分析全基因組重測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)常山胡柚超過87.91%的遺傳組分為柚橘雜合成分，且常山胡柚的全基因組序列與酸橙的相似度較高，最高可達88.34%，聚類分析顯示常山胡柚與酸橙聚類在一起，表明常山胡柚是一種酸橙，符合常山胡柚ITSIB序列與酸橙完全一致的報道。而對于酸橙的親本，目前普遍認為酸橙是柚與寬皮橘的F₁代后代，且柚很可能是母本。該觀點從同工酶、細胞學以及分子標記等多個方面得到證實。相關研究也驗證了酸橙起源的模式，何發(fā)通過SSR分子標記驗證酸橙起源模式為柚×橘，Wu等從多份柑橘屬資源的全基因組數(shù)據(jù)進行分析證實了酸橙的親本為柚和寬皮橘。常山胡柚作為一種酸橙，推測其親本為柚和橘，與前人報道常山胡柚的起源過程中柚和寬皮柑橘可能是主要的起源親本相吻合。

分子標記技術自20世紀80年代開始廣泛應用，也常常應用于果樹種質資源鑒定與遺傳分類。InDel標記作為一種新型分子標記，適用于分析近緣物種間的基因組上同一位點序列插入和缺失的差異，且InDel標記開發(fā)成本較低、準確性高、多態(tài)性強和檢測簡便，因此受到廣泛認可和應用。本研究對橘、柚、常山胡柚、酸橙和葡萄柚基因組重測序數(shù)據(jù)進行篩選，開發(fā)特異性InDel分子標記進一步印證常山胡柚的親緣關系與酸橙相近，而非柚與葡萄柚。此外，在今后的研究中，也有望通過InDel標記應用于常山胡柚的精準育種中，為育種實踐提供理論依據(jù)。

枳殼作為常用的大宗藥材，如湘枳殼、川枳殼、江枳殼等都是傳統(tǒng)中藥材，其次生代謝物常用于藥理研究，大部分地區(qū)標準均收載酸橙及其栽培變種作為枳殼的基原植物，如新疆、云南、香港等。常山胡柚未成熟果實可直接入藥，自2016年以“衢枳殼”載入《浙江省中藥炮制規(guī)范》后命名為衢枳殼，正式成為一味中藥材，表明常山胡柚為酸橙或酸橙的栽培種，與本研究鑒定常山胡柚是一種酸橙的結論相符，另本研究也可為常山胡柚用于中藥材開發(fā)與應用提供遺傳依據(jù)。

4結論

通過對常山胡柚進行形態(tài)學、果實品質、基因組重測序分析與InDel分子標記驗證，初步明確常山胡柚為酸橙遺傳背景，推測是經(jīng)長期栽培馴化后形成的一種果實品質改良的酸橙。這對柑橘資源的分類鑒定提供參考，為進一步探究常山胡柚的遺傳起源進化提供依據(jù)，同時開發(fā)的InDel標記也有望應用于柑橘育種材料鑒定，為育種實踐提供理論依據(jù)。