李香靈，崔安芳，黃延紅，馬曉磊

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)寧 272067）

基因的突變和缺失會(huì)干擾正常的代謝途徑、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和配體/受體功能，導(dǎo)致許多疾病的發(fā)展，而基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)為這些疾病提供了一種新的解決方案[1]。在臨床上，基因編輯技術(shù)已經(jīng)用于糾正和治療一些遺傳性疾病，如地中海貧血[2]、高膽固醇血癥[3]、先天性黑蒙癥[4]等，還可以用于治療艾滋病、癌癥和阿爾茨海默病等后天性疾病[5-6]。但基因編輯技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化和大規(guī)模應(yīng)用仍處于初級(jí)階段。RNAi 和CRISPR-Cas9 系統(tǒng)是近年來(lái)最具代表性的基因編輯技術(shù)。RNA 干擾（RNA interference，RNAi）可以在信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）水平上抑制基因表達(dá)，而規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）和其相關(guān)蛋白（CRISPR-associated protein，Cas）可以方便、高效和精確地切割靶位點(diǎn)的DNA 雙鏈[7]。本文將對(duì)RNAi 和CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的基因編輯機(jī)制進(jìn)行概述，并介紹RNAi 和CRISPRCas9 在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的相關(guān)應(yīng)用和面臨的挑戰(zhàn)。

1 RNA 干擾技術(shù)

1.1 原理與機(jī)制

RNAi 是一種轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控機(jī)制，可以由小干擾RNA（siRNA）、短發(fā)夾RNA（shRNA）、微小RNA（miRNA）以及其他非編碼RNA（如piRNA）觸發(fā)[8]。雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）可以通過(guò)這種機(jī)制誘導(dǎo)mRNA的序列特異性降解或抑制mRNA的功能[9]。如圖1 所示，核糖核酸內(nèi)切酶Dicer 通過(guò)切割較長(zhǎng)的dsRNA 或shRNA 產(chǎn)生擁有21 ～23 個(gè)堿基的成熟的siRNA[10]。經(jīng)加工后，成熟的siRNA 被整合到包括Dicer 和Ago-2 在內(nèi)的RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-Induced Silencing Complex，RISC）中[11]。隨后siRNA 在RISC 中被分離成正義鏈和反義鏈，正義鏈被釋放，而反義鏈被保留下來(lái)通過(guò)與靶標(biāo)的互補(bǔ)結(jié)合觸發(fā)靶標(biāo)序列被Ago-2 內(nèi)切酶切割[12]。臨床治療中，可以通過(guò)直接給予人工制備的siRNA 來(lái)繞過(guò)Dicer 介導(dǎo)的形成成熟siRNA 的初始步驟。

圖1 siRNA 作用機(jī)制示意圖

1.2 應(yīng)用領(lǐng)域

自2018 年第一款siRNA 藥物上市以來(lái)，目前已有5 種siRNA 藥 物（patisiran、givosiran、lumasiran、inclisiran 和vutrisiran）獲批[3,13-16]，還有58 種siRNA藥物處于臨床階段。siRNA 在癌癥治療和抗病毒等領(lǐng)域同樣進(jìn)展迅速，包括脂質(zhì)體、脂質(zhì)納米粒和抗體在內(nèi)的各種載體已被用于體內(nèi)外傳遞siRNA[17-18]。

1.2.1 癌癥治療

與化療等傳統(tǒng)方法相比，siRNA 介導(dǎo)的抗癌治療有以下優(yōu)點(diǎn)[19]：（1）特異性高，副作用??；（2）通過(guò)級(jí)聯(lián)放大作用進(jìn)一步沉默靶mRNA；（3）可以同時(shí)抑制多個(gè)腫瘤基因；（4）易于合成，生產(chǎn)成本低。

目前已有多種siRNA 抗癌藥物進(jìn)入臨床。Atu027是一種被包裹在脂質(zhì)納米顆粒中的siRNA，靶向致癌基因蛋白激酶N3（Protein Kinase N3，PKN3），臨床試驗(yàn)（NCT00938574）顯示其聯(lián)合吉西他濱對(duì)晚期或轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者有良好的活性和安全性[20-21]。siG12D LODER 是一種局部長(zhǎng)效siRNA 遞送系統(tǒng)，靶向突變的大鼠肉瘤（RAS）蛋白，I 期臨床研究顯示其在胰腺癌患者中有良好安全性和有效性[22]。APN-401 可以減少自體外周血單核細(xì)胞中E3 泛素連接酶（Casitas B-lineage lymphoma proto-oncogene b，Cbl-b）的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)免疫反應(yīng)，I 期臨床研究顯示其在癌癥患者中誘導(dǎo)了長(zhǎng)期的疾病穩(wěn)定[23]。

1.2.2 抗病毒

siRNA 能以高特異性和低毒性的特征沉默靶基因，并且由于siRNA 序列能被快速設(shè)計(jì)并合成，使其能適應(yīng)病毒的各種突變。

早期的RNAi 療法使用單個(gè)siRNA 序列治療病毒感染。例如，ALN-RSV01 是一種靶向呼吸道合胞體病毒非結(jié)構(gòu)核衣殼蛋白mRNA 的單一siRNA，目前已成功進(jìn)入Ⅱb 期臨床試驗(yàn)[24]。最近的RNAi 療法通過(guò)使用多個(gè)siRNA 序列來(lái)克服病毒的高突變率，防止由于單個(gè)靶點(diǎn)突變而引起藥物失效[18]。例如，TKM-130803 由兩種等比例的siRNA 分子組成，以脂質(zhì)納米顆粒為載體，通過(guò)同時(shí)靶向病毒的siLpol-2 RNA 和siVP35-2 RNA 抑制埃博拉病毒復(fù)制[25]。TENG 等[26]報(bào)道了靶向波恩病毒的TD-Borna 混合物，通過(guò)同時(shí)靶向病毒包殼必需的N-mRNA 和病毒RNA 合成必需的L-mRNA 來(lái)抑制病毒。

2 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)

2.1 原理與機(jī)制

CRISPR 系統(tǒng)由單引導(dǎo)RNA（single guide RNA，sgRNA）和DNA 內(nèi)切酶Cas 蛋白組成，可以在基因組的目標(biāo)位置引入平末端雙鏈斷裂（Double-Stranded Breaks，DSBs）[27]。如圖2 所示，CRISPR-Cas9 復(fù)合物通過(guò)尋找原間隔相鄰基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM）與DNA 鏈接觸，隨后CRISPR-Cas9 復(fù)合物解開(kāi)PAM 序列附近的前10 ～12 個(gè)核苷酸[28-29]。如果sgRNA 的前8 ～12 個(gè)核苷酸與DNA 發(fā)生互補(bǔ)結(jié)合，則Cas9 中的HNH 核酸酶結(jié)構(gòu)域和RuvC 結(jié)構(gòu)域會(huì)分別切割初級(jí)DNA 鏈和次級(jí)DNA 鏈[30]修復(fù)DSBs有兩種高度保守的機(jī)制：非同源末端連接（Non-Homologous End Joining，NHEJ）途徑和同源定向修復(fù)（Homology-Directed Repair，HDR）途徑[31]。通過(guò)NHEJ 修復(fù)的DNA 通常導(dǎo)致基因被破壞，常用于減少致病基因的過(guò)度表達(dá)。相反，HDR 可以在存在修復(fù)模板的情況下觸發(fā)，并用于有意糾正基因突變或插入合成序列[32]。

圖2 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)作用機(jī)制示意圖

2.2 應(yīng)用領(lǐng)域

目前進(jìn)入臨床的CRISPR-Cas9 療法的適應(yīng)癥包括各種遺傳疾病。例如，Exagamglogene Autotemcel通過(guò)靶向血紅蛋白來(lái)改善地中海貧血，目前已經(jīng)申請(qǐng)上市[2]。AGN-151587 通過(guò)調(diào)節(jié)Cep290 基因治療先天性黑蒙癥，目前處于臨床Ⅱ期[4]。同時(shí)CRISPRCas9 系統(tǒng)在癌癥、病毒感染等領(lǐng)域的研究也發(fā)展迅速[33]。絕大多數(shù)CRISPR-Cas9 臨床試驗(yàn)都從患者身上提取特定細(xì)胞，進(jìn)行富集和基因編輯，然后重新引入患者體內(nèi)，這有助于提高基因編輯效率并降低藥物毒性。除了離體方法，CRISPR-Cas9 也可以通過(guò)載體進(jìn)行體內(nèi)基因編輯。

2.2.1 癌癥

CRISPR-Cas9 技術(shù)在癌癥治療中的應(yīng)用，一方面是產(chǎn)生嵌合抗原受體T（Chimeric Antigen Receptor-T，CAR-T）細(xì)胞，通過(guò)收集患者T 細(xì)胞并進(jìn)行CRISPRCas9 基因編輯，達(dá)到在體外攻擊癌癥抗原的目的，然后將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移回患者體內(nèi)。OTTAVIANO 等[34]使用CRISPR-Cas9 系統(tǒng)敲除了CAR19 T 細(xì)胞的T 細(xì)胞受體α 恒定區(qū)（T Cell Receptor Alpha Constant，TRAC）和分化簇52（Cluster of Differentiation 52，CD52），在I 期臨床實(shí)驗(yàn)中對(duì)兒童B 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病有一定療效。GIUFFRIDA 等[35]報(bào)道了CRISPRCas9 介導(dǎo)的腺苷2A 受體缺失增強(qiáng)了嵌合抗原受體T 細(xì) 胞（Chimeric AntigenReceptor T-cell，CAR-T細(xì)胞）效應(yīng)功能，在臨床前模型中顯示出良好的療效。另一方面，CRISPR-Cas9 也可用于取代主要組織相容性復(fù)合體（Major Histocompatibility Complex，MHC）等位基因。MEISSNER 等[36-37]使用CRISPRCas9 敲除CD4+T 細(xì)胞中的β2-微球蛋白（beta-2-microglobulin，B2M）基因，導(dǎo)致MHC-I 表面表達(dá)喪失，從而產(chǎn)生大量可轉(zhuǎn)移的T 細(xì)胞，顯示出強(qiáng)大的抗白血病功能。CROWTHER 等[38]通過(guò)CRISPR-Cas9 系統(tǒng)敲除MHC-I 類(lèi)相關(guān)蛋白MR1，確認(rèn)其在多種癌癥上表達(dá)，并可以被T 細(xì)胞靶向，為癌癥治療提供新的思路。CRISPR-Cas9 還可以編輯干細(xì)胞和免疫應(yīng)答細(xì)胞中的基因。例如，程序性死亡受體1（Programmed Cell Death Protein 1，PD-1）可以被CRISPR-Cas9 技術(shù)靶向并敲除，該技術(shù)對(duì)肝癌（NCT04417764）、肺癌（NCT02793856）和前列腺癌癥（NCT03525652）的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中[39]。

2.2.2 抗病毒

CRISPR-Cas9 系統(tǒng)可以特異性靶向和破壞病毒的基因。TIAN 等[40]計(jì)劃通過(guò)CRISPR-Cas9 敲除HPV病毒E6 和E7 基因來(lái)治療HPV 相關(guān)的宮頸上皮內(nèi)瘤變（NCT03057912）。SEEGER 等[41]證明CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以特異性地破壞乙型肝炎病毒中的共價(jià)閉合環(huán)形DNA（covalenr closed circular DNA，cccDNA）以達(dá)到治療效果。WANG 等[42]證明CRISPR-Cas9 可以抑制人類(lèi)皰疹病毒4 型（Epstein-Barr virus，EBV）基因的表達(dá)，通過(guò)在病毒感染的潛伏期精確靶向病毒基因組來(lái)減少感染。WOLLEBO 等[43]證明通過(guò)CRISPRCas9 可以在轉(zhuǎn)化的人類(lèi)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中滅活編碼T抗原的基因并抑制多瘤病毒JC 的復(fù)制。

3 RNAi 與CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的應(yīng)用挑戰(zhàn)

盡管RNAi 和CRISPR-Cas9 相關(guān)療法的開(kāi)發(fā)在過(guò)去十年中進(jìn)展迅速，但組織靶向遞送困難和脫靶效應(yīng)仍較大地限制了其臨床應(yīng)用，因此提高藥物傳遞效率和特異性是未來(lái)主要的研究方向。

3.1 傳遞效率

裸露或未修飾的siRNA 以及CRISPR-Cas9 系統(tǒng)容易被人體各種酶降解，導(dǎo)致傳遞效率低下，因此需要尋找高效的載體。納米載體是遞送siRNA 的常用載體，可以保護(hù)siRNA 免受核酸酶降解，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)siRNA 的攝取。但納米顆粒的穩(wěn)定性差，并且在腫瘤組織中分布不均勻。病毒載體（例如腺病毒）是遞送CRISPR-Cas9 最全面的載體，具有致癌風(fēng)險(xiǎn)低、免疫原性低等優(yōu)勢(shì)，但可能會(huì)增加藥物脫靶效應(yīng)[44]。而非病毒遞送（如納米顆粒）可以更精確地控制給藥的劑量和時(shí)間，降低脫靶效應(yīng)和潛在副作用，但也存在整體尺寸大導(dǎo)致遞送困難，編輯效率低等問(wèn)題[46]。因此研究人員需要尋找適合的遞送系統(tǒng)，以提高基因編輯工具的傳遞效率。

3.2 特異性

RNAi 與CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的另一個(gè)挑戰(zhàn)是特異性。siRNA 分子可能發(fā)生脫靶沉默，從而導(dǎo)致基因發(fā)生有害突變。研究表明，脫靶沉默的原因是siRNA有6 ～7 個(gè)核苷酸與脫靶基因存在同源性[46-47]。而CRISPR-Cas9 技術(shù)經(jīng)常在不需要的基因組位點(diǎn)造成片段基因的插入或缺失，導(dǎo)致基因突變并產(chǎn)生毒性。KLEINSTIVER 等[48]的研究表明，可以通過(guò)修飾Cas9蛋白以改變候選識(shí)別位點(diǎn)的毗鄰基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM）偏好或增強(qiáng)對(duì)靶DNA 的識(shí)別，這可以降低脫靶效應(yīng)的頻率，如有研究人員通過(guò)設(shè)計(jì)新Cas 酶來(lái)優(yōu)化基因編輯特異性[49-51]。

4 展望

RNAi 作為一種精確調(diào)控基因表達(dá)的工具，可以實(shí)現(xiàn)特定基因沉默，在基因治療、癌癥治療、遺傳病治療等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。然而，RNAi 仍面臨傳遞效率和特異性的挑戰(zhàn)，需要開(kāi)發(fā)更有效的遞送系統(tǒng)和更穩(wěn)定的RNA 分子，以提高傳遞效率和特異性。CRISPR-Cas9 系統(tǒng)為編輯基因組提供了強(qiáng)大的工具，并在基因功能研究和疾病治療中展示出巨大的應(yīng)用前景。然而，CRISPRCas9 系統(tǒng)精確性和安全性需要進(jìn)一步改進(jìn)和評(píng)估，以減少非特異性基因編輯和潛在的副作用。

RNAi 和CRISPR-Cas9 系統(tǒng)在醫(yī)學(xué)研究和臨床實(shí)踐中的應(yīng)用領(lǐng)域需要進(jìn)一步拓展。除了目前研究較多的抗癌和抗病毒領(lǐng)域，未來(lái)的研究可以探索這些技術(shù)在神經(jīng)退行性疾病、免疫系統(tǒng)疾病、傳染病等更多領(lǐng)域的潛在應(yīng)用。此外，結(jié)合RNAi 和CRISPR-Cas9系統(tǒng)，可以開(kāi)發(fā)出更多種類(lèi)的組合治療策略，以提高療效并克服單一療法的局限性。