董然然

（濮陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南濮陽(yáng) 457000）

關(guān)鍵字：外泌體；核酸；載體；癌癥

癌癥仍然是全球主要的死亡原因之一，每年有4.1 億例死亡病例[1]。癌癥的各種治療方法，如手術(shù)治療、化療和放療等雖然能降低癌癥死亡率，但這些方法副作用大，可能出現(xiàn)諸如高復(fù)發(fā)率、巨大的創(chuàng)傷、低生存率生活質(zhì)量受損等各種問(wèn)題[1]。因此，迫切需要開發(fā)安全和有效癌癥的技術(shù)。

基因治療是將治療性遺傳物質(zhì)傳遞入細(xì)胞，通過(guò)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生缺陷蛋白質(zhì)基因或引入基因來(lái)補(bǔ)償異?；?，是一種安全、有效的治療各種疾病的方法。基因治療的效果取決于核酸藥物的靶向性、給藥時(shí)間和給藥工具的準(zhǔn)確性。核酸包括特異性DNA、信使RNA（mRNA）、microRNA（miRNA）、小干擾RNA（siRNA）和環(huán)狀RNA（circRNA）[2]，廣泛應(yīng)用于基因治療。然而，核酸帶負(fù)電荷且親水，不能直接穿透細(xì)胞膜，容易被酶降解，不能單獨(dú)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞，因此需要開發(fā)合適的運(yùn)載介質(zhì)。外泌體是由不同細(xì)胞釋放到細(xì)胞外基質(zhì)的小膜性囊泡，大小為40 ～150 nm，可以參與通信[3]。由于其在納米維度，外泌體被認(rèn)為是最有前途的藥物傳遞工具。本文介紹了外泌體的特點(diǎn)，重點(diǎn)介紹了其作為DNA、信使RNA（mRNA）、microRNA（miRNA）、小干擾RNA（siRNA）、環(huán)狀RNA（circRNA）等核酸的傳遞載體的應(yīng)用。同時(shí)，介紹并討論了它們?cè)诎┌Y治療和外泌體臨床試驗(yàn)中的應(yīng)用。系統(tǒng)總結(jié)和分析了外泌體介導(dǎo)的核酸傳遞用于癌癥治療的研究進(jìn)展和挑戰(zhàn)，為核酸藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 外泌體作為核酸載體的優(yōu)勢(shì)

與傳統(tǒng)的脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）等遞送系統(tǒng)相比，外泌體具有以下優(yōu)點(diǎn)[4]：（1）外泌體在體液中比LNPs 更穩(wěn)定；（2）外泌體由于其內(nèi)源性來(lái)源和較高的生物相容性，具有相對(duì)較低的細(xì)胞毒性和免疫原性；（3）外泌體在給藥過(guò)程中可以提供更好的藥物保護(hù)，因?yàn)樗幬镌陔p層外泌體膜內(nèi)，比位于LNPs 外的藥物穩(wěn)定性更好；（4）外泌體可以傳遞疏水分子和親水分子，對(duì)腫瘤部位高效的歸巢能力可能是因?yàn)樗鼈儗?duì)細(xì)胞來(lái)源的表面部分的多價(jià)顯示；（5）來(lái)自腫瘤的外泌體通過(guò)與外泌體表面的CD47 和巨噬細(xì)胞表面的信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白alpha（SIRPα）結(jié)合，逃脫單核吞噬系統(tǒng)的吞噬；（6）外泌體由于其體積小的特點(diǎn)，可以穿過(guò)血腦屏障到達(dá)腦組織；（7）外泌體具有較高的細(xì)胞攝取能力，由于四酯蛋白和纖維連接蛋白等膜蛋白，很容易根據(jù)靶細(xì)胞進(jìn)行修飾。

2 基于外泌體的核酸傳遞系統(tǒng)在癌癥治療中的應(yīng)用

2.1 治療性DNA 的傳遞

外泌體通過(guò)內(nèi)吞作用將各種功能化的DNA 注入細(xì)胞，以治療癌癥。然而，由于其尺寸小，通過(guò)外泌體包裝大DNA 的效率非常低，這限制了基于外泌體的藥物傳遞系統(tǒng)的應(yīng)用。有研究表明[5]，使用相對(duì)較小的反義寡核苷酸（ASO）和質(zhì)粒DNA，或工程修飾的外泌體可以解決這個(gè)問(wèn)題。Codiak 生物科學(xué)公司[6]發(fā)表了工程外泌體傳遞ASO（exoASO）的臨床前數(shù)據(jù)，表明exoASO 向M2 巨噬細(xì)胞靶向關(guān)鍵免疫抑制轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子6（STAT6）和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBP）表達(dá)的潛力。結(jié)果顯示，與exoASO治療相關(guān)的TNF 和IL-10 的表達(dá)分別增加了40 倍和29 倍，這與免疫抑制M2 巨噬細(xì)胞向免疫刺激M1巨噬細(xì)胞的復(fù)極化相一致，而exoASO-STAT6 顯著減緩了腫瘤生長(zhǎng)，50%的小鼠腫瘤完全消退。當(dāng)exoASO-STAT6 與抗程序性死亡受體-1（PD-1）抗體聯(lián)合使用時(shí)，腫瘤緩解率進(jìn)一步提高了25%。

此外，隨著CRISPR/cas9 介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)的興起，人們也在嘗試通過(guò)外泌體傳遞cas9 編碼質(zhì)粒。例如，KIM 等[7]報(bào)道，卵巢癌來(lái)源的外泌體（SKOV3-Exo）可以在體內(nèi)通過(guò)電穿孔方式有效傳遞CRISPR/Cas9 質(zhì)粒，以抑制多聚ADP-核糖聚合酶1（PARP-1）的表達(dá)。與單獨(dú)使用SKOV3-Exo 相比，CRISPR/cas9 負(fù)載SKOV3-Exo 治療后PARP-1 的表達(dá)被完全抑制，腫瘤內(nèi)注射治療20 d 內(nèi)，治療組的腫瘤體積幾乎沒(méi)有變化，而對(duì)照組的腫瘤體積保持增長(zhǎng)。

2.2 治療性mRNA 的傳遞

mRNA 被核酸酶降解，從而激活免疫反應(yīng)，這已成為mRNA 藥物開發(fā)的主要障礙。外泌體作為一種天然的傳遞載體，可以實(shí)現(xiàn)mRNA 的有效傳遞。WANG 等[8]應(yīng)用外泌體將編碼HChrR6 的mRNA（通過(guò)轉(zhuǎn)染XPort/HChrR6 編碼質(zhì)粒產(chǎn)生）傳遞到HER2+ve 人乳腺癌細(xì)胞，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。YANG 等[9]報(bào)道了一種細(xì)胞納米穿孔技術(shù)，用于生產(chǎn)大量含有治療性mRNA 外泌體，在此基礎(chǔ)上，磷酸酯酶與張力蛋白同源物（PTEN）CDX（CD47 克隆目標(biāo)肽）質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到膠質(zhì)瘤細(xì)胞獲得大量的目標(biāo)功能性外泌體，增強(qiáng)細(xì)胞攝取，恢復(fù)PTEN 蛋白的表達(dá)，抑制腫瘤生長(zhǎng)。表明外泌體介導(dǎo)的mRNA 傳遞在癌癥治療中具有很好的潛力。

2.3 治療性miRNA 的傳遞

MicroRNA（miRNA）是一種可以調(diào)控基因表達(dá)的非編碼RNA。某些miRNA 的異常表達(dá)會(huì)影響疾病的進(jìn)展，如腫瘤。恢復(fù)這些miRNA 的表達(dá)可以抑制腫瘤的進(jìn)展，這為腫瘤治療提供了一種新的方法。然而，miRNA 在體內(nèi)很容易被降解，通過(guò)外泌體傳遞可以避免這一問(wèn)題。

KATAKOWSKI 等[10]報(bào)道，外泌體轉(zhuǎn)移miRNA-146b（miR-146b）可以通過(guò)靶向表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，腫瘤內(nèi)注射外泌體miR-146b 顯著降低大鼠模型中膠質(zhì)瘤異種移植物的生長(zhǎng)。此外，外泌體miRNA 抑制劑的傳遞，干擾腫瘤促進(jìn)的miRNA，可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移。ZENG 等[11]發(fā)現(xiàn)，高水平的血清外泌體miR253p 與結(jié)腸直腸癌（CRC）轉(zhuǎn)移相關(guān)。CRC 細(xì)胞外泌體miR253p 可通過(guò)靶向肺Krüppel 樣轉(zhuǎn)錄因子（KLF2 和KLF4），促進(jìn)CRC 誘導(dǎo)的血管通透性和血管生成，從而促進(jìn)CRC轉(zhuǎn)移。這些研究表明，利用外泌體平衡這些miRNA的表達(dá)水平在腫瘤治療中具有重要意義。

2.4 治療性siRNA 的傳遞

癌癥進(jìn)展與抗凋亡蛋白[如B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（BCL-2）、Polo 樣激酶1（PLK1）、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）]、啟動(dòng)細(xì)胞有絲分裂的生存蛋白和細(xì)胞生長(zhǎng)因子的上調(diào)有關(guān)[12]。靶向腫瘤細(xì)胞的siRNA 外泌體治療已被認(rèn)為可下調(diào)這些致癌基因的表達(dá)，以抑制細(xì)胞的增殖和遷移。KABAN 等[12]將BCL-2 siRNA 裝入自然殺傷（NK）細(xì)胞來(lái)源的外泌體中，治療ER+乳腺癌，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞凋亡增強(qiáng)。表明外泌體介導(dǎo)的siRNA 傳遞可以有效地抑制癌細(xì)胞的增殖和遷移。

然而，耐藥性是癌癥治療中的另一個(gè)主要挑戰(zhàn)。一般來(lái)說(shuō)，化療耐藥相關(guān)蛋白的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致癌細(xì)胞耐藥，利用siRNA克服耐藥性已被廣泛報(bào)道[13]。LIN等[14]利用iRGD 環(huán)肽修飾的外泌體特異性地將（siCPT1A）傳遞到結(jié)腸癌細(xì)胞中，以抑制脂肪酸的氧化作用缺陷（FAO），逆轉(zhuǎn)了耐藥結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性。上述方法可有效減輕癌細(xì)胞的耐藥性，為腫瘤治療提供新的思路。

2.5 治療性環(huán)狀RNA 的傳遞

外泌體自然攜帶的環(huán)狀RNA 已被廣泛開發(fā)用于癌癥治療，由于其遞送效率，大大提高了治療效果。然而，外泌體修飾的外源性環(huán)狀RNA 的傳遞也面臨著一些挑戰(zhàn)：環(huán)狀RNA 的特殊結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了較少的環(huán)狀結(jié)構(gòu)[15]；大分子環(huán)狀RNA 也面臨著與上面討論的大尺寸mRNA相同的問(wèn)題，它不需要加載到外泌體中。為了解決這些問(wèn)題，YANG 等[16]將靶circRNA_DYM編碼DNA 構(gòu)建到慢病毒表達(dá)載體中，然后將RVGLamp2b 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293T 細(xì)胞中，分泌穩(wěn)定過(guò)表達(dá)靶circRNA_DYM 的基因外泌體（RVG-circDYMEX）。它不僅可以使環(huán)狀RNA 正確、有效地環(huán)化，還可以很容易地裝載到外泌體中。RVG-circDYMEX 通過(guò)結(jié)合TATA-box 結(jié)合蛋白相關(guān)因子1（TAF1）并下調(diào)多個(gè)下游基因（TRPM6，Cyp39al），以減輕慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙。circRNA 的環(huán)狀結(jié)構(gòu)不僅可以防止被降解，提高circRNA 的表達(dá)時(shí)間和表達(dá)量，而且可以反復(fù)給藥，使其成為新興的核酸藥物之一。

3 外泌體的批量生產(chǎn)

雖然相關(guān)理論已經(jīng)取得了重大的進(jìn)展，但為臨床試驗(yàn)大規(guī)模生產(chǎn)外泌體仍存在一定的困難，目前已經(jīng)開發(fā)了生物反應(yīng)器、3D 裂模和微融合裝置等設(shè)備。例如，HARASZTI 等[17]應(yīng)用3D 培養(yǎng)結(jié)合切向弓狀生長(zhǎng)法（TFF），與2D 或3D 培養(yǎng)或TFF 相比，外泌體的產(chǎn)量增加了140 倍。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[18]，使用中空FBER 生物反應(yīng)器可以將外泌體的產(chǎn)量提高40 倍。WANG 等[19]報(bào)道，3D 納米結(jié)構(gòu)微融合芯片可以捕獲90%的外泌體。此外，一些研究表明[20]，應(yīng)激環(huán)境，如缺氧、低pH 值和抗癌藥物，可以刺激更多的外泌體的產(chǎn)生。

4 結(jié)語(yǔ)

與傳統(tǒng)的納米載體相比，外泌體具有較低的免疫原性、較低的毒性和更好的跨越生物屏障的能力。基于這些優(yōu)點(diǎn)，外泌體在核酸傳遞方面顯示出了巨大的價(jià)值，并可以保護(hù)治療物質(zhì)不被宿主免疫系統(tǒng)降解和清除。此外，其親本細(xì)胞固有的靶向能力使外泌體具有靶向傳遞的潛力，增強(qiáng)了穿透腫瘤血管屏障和腫瘤部位生物積累的能力，大大提高了其治療能力。以外泌體為基礎(chǔ)的傳遞系統(tǒng)在癌癥治療方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。但目前的外泌體-核酸裝載策略的低負(fù)載率，包括電穿孔、孵育和轉(zhuǎn)染，限制了其應(yīng)用。另外，外泌體的異質(zhì)性和復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境限制了精確的傳遞和預(yù)期的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)癌癥的個(gè)性化精確治療也是未來(lái)的一個(gè)研究方向。