張雪陽，羅順*

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西南昌 330004；2.長三角藥物高等研究院，江蘇海門 226133；3.澳斯康生物（南通）股份有限公司，江蘇南通 226133）

癌癥是全球范圍內(nèi)的一個主要公共衛(wèi)生問題，也是人類主要的死亡原因之一。在臨床上，癌癥的早期發(fā)現(xiàn)對于開發(fā)設(shè)計預(yù)后更好的癌癥治療方法非常重要。目前，大多數(shù)癌癥是通過測量生物標(biāo)志物進(jìn)行診斷，盡管臨床上批準(zhǔn)的各種生物標(biāo)志物在市場上廣泛應(yīng)用，但對于最常見的癌癥尚未發(fā)現(xiàn)具有可靠、準(zhǔn)確性能的單一生物標(biāo)志物。因此，需要開發(fā)具有更好診斷和預(yù)后能力的新型生物標(biāo)志物。糖結(jié)合物如糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖是通過糖基化的過程形成的。幾乎所有細(xì)胞表面和分泌的蛋白質(zhì)都會發(fā)生糖基化，異常的糖基化已被認(rèn)為是癌癥的標(biāo)志之一。糖結(jié)合物的合成是一個動態(tài)過程，它發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中，受底物利用率、酶活性、基因轉(zhuǎn)錄水平和酶在細(xì)胞器中的定位等因素控制。合成的聚糖參與各種生理和病理細(xì)胞功能，如細(xì)胞信號傳導(dǎo)、腫瘤侵襲、細(xì)胞-基質(zhì)相互作用、腫瘤血管生成、免疫調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)移形成。由于糖基化的改變與腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展密切相關(guān)，異常的糖基化結(jié)構(gòu)可以作為生物標(biāo)志物或治療的特異性靶點(diǎn)。

1 蛋白質(zhì)糖基化

蛋白質(zhì)糖基化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，指在酶的控制下，蛋白質(zhì)附加上糖類的過程，起始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，結(jié)束于高爾基體。在糖基轉(zhuǎn)移酶作用下將糖轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)，和蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基形成糖苷鍵。蛋白質(zhì)經(jīng)過糖基化作用，形成糖蛋白，糖蛋白有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、幫助蛋白質(zhì)折疊功能作用。

蛋白質(zhì)糖基化大致分為4 種類型，分別是N-糖基化、O-糖基化、糖基磷脂酰肌醇錨定連接及色氨酸殘基的C-甘露糖化[1]。在真核生物中，可以發(fā)生糖基化的蛋白質(zhì)占50%以上，其中N-糖基化占90%。N-糖基化是通過糖鏈還原端N-乙酰葡萄糖胺與特定肽段序列（Asn-X-Ser/Thr，X 為除脯氨酸外任一氨基酸）上天冬酰胺的-NH2殘基相連。N-糖基化存在五糖核心結(jié)構(gòu)——Man3-GlcNAc2-Asn，根據(jù)其糖型的種類和連接方式分為高甘露糖型、復(fù)雜型和雜合型3 種類型。

2 蛋白質(zhì)N-糖基化在常見癌癥診斷中的應(yīng)用

現(xiàn)如今，臨床上常用于檢測的五項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物包括甲胎蛋白、癌胚抗原、糖類抗原等。然而，因患者個體差異、患者具體臨床情況等因素，腫瘤的確診還要有組織或細(xì)胞病理學(xué)的診斷依據(jù)，腫瘤標(biāo)志物的分析要結(jié)合臨床情況才能得出客觀真實(shí)的結(jié)論。

蛋白質(zhì)糖基化可以影響腫瘤的生物學(xué)行為，其主要受糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶的調(diào)控。腫瘤發(fā)生的早期階段通常伴隨著腫瘤細(xì)胞糖基化的改變，某些腫瘤相關(guān)的糖基化會在不同類型的癌癥前體病變中表達(dá)，從而使它們成為腫瘤或癌癥的早期診斷標(biāo)志[2]。

2.1 胃癌中蛋白質(zhì)糖基化的改變

胃癌（Gastric Cancer，GC）是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，是全球第三致命的癌癥。絕大多數(shù)胃癌屬于腺癌，早期無明顯癥狀，常與胃炎、胃潰瘍等胃慢性疾病癥狀相似，易被忽略，因此我國胃癌的早期診斷率仍較低。研究表明，胃癌的發(fā)生是由于關(guān)鍵信號通路的累積突變及其相關(guān)基因中糖基化的改變[3]?，F(xiàn)臨床用于胃癌診斷標(biāo)記物是腫瘤相關(guān)抗原，但敏感性和特異性均不高。蛋白質(zhì)糖基化通常發(fā)生在惡性病變的早期，因此進(jìn)一步探討糖基化在胃癌中的變化將有助于發(fā)現(xiàn)新的胃癌標(biāo)志物，從而改善胃癌患者的預(yù)后具有重要意義。

有關(guān)研究[4]分析了非萎縮性胃炎（Non-Atrophic Gastritis，NAG）、十二指腸潰瘍（Duodenal Ulcer，DU）、腸型胃癌（Intestinal Gastric Cancer，IGC）和彌漫型胃癌（Diffuse Gastric Cancer，DGC）患者的IgG 糖基化模式，包括Fab 和Fc 糖基化。在NAG、DU 和GC中使用方差分析，結(jié)果顯示，在截斷、雙天線和唾液酸聚糖組診斷組之間觀察到顯著差異。另外，與NAG組相比，GC 組觀察到截斷聚糖的水平顯著增加，而雙天線聚糖的水平明顯下降。在DU 組和GC 組，唾液酸化聚糖顯著減少。在NAG 和GC 不同的8 種聚糖中，5 種非半乳糖基化結(jié)構(gòu)在GC 中水平升高，而3 種完全半乳糖基化的聚糖水平降低，表明GC 患者IgG 半乳糖丟失。有8 種聚糖組成在DU 和GC 之間發(fā)生了顯著變化，其中含有巖藻糖的非半乳糖基化和單半乳糖基化的聚糖在GC 中增加，而具有二分GlcNAC 和三元唾液酸基的全半乳糖基化的聚糖含量減少。這些發(fā)現(xiàn)有望成為胃癌的預(yù)測指標(biāo)，可以區(qū)分非惡性DU 和GC。

另有文獻(xiàn)[5]對正常人和胃癌患者的結(jié)合珠蛋白糖基化進(jìn)行了廣泛研究，共有23 個單獨(dú)的糖肽被確定為潛在的生物標(biāo)志物。結(jié)合珠蛋白的糖基化與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，尤其是ASN241糖基化與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。該方法不僅可以快速、簡便地獲得目標(biāo)蛋白糖基化異質(zhì)性的信息，而且可以作為生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和診斷臨床相關(guān)疾病。

2.2 肺癌中蛋白質(zhì)糖基化的改變

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤，也是癌癥死亡的主要原因。在我國，每年肺癌新發(fā)病例約為54萬例，每年死亡病例超過48 萬例[6]。肺癌的類型主要分為小細(xì)胞癌和非小細(xì)胞癌，最常見的非小細(xì)胞肺癌類型包括鱗狀細(xì)胞肺癌、肺腺癌、大細(xì)胞癌。盡管目前對腫瘤生物學(xué)的理解和治療策略有進(jìn)步，但肺癌患者的5 年生存率仍不高。預(yù)后不良的主要原因之一是大多數(shù)肺癌患者都是在癌癥晚期被診斷出來，錯過了手術(shù)切除的最佳時機(jī)。

研究表明，低表達(dá)β-1,6-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V（N-Acetylglucosaminyl-Transferase-V，GnT-V）與非小細(xì)胞癌生存期短、預(yù)后差有關(guān)。GnT-V 在正常肺中表達(dá)，由GnT-V 合成的β-1,6 分支寡糖在正常支氣管上皮細(xì)胞和肺泡肺細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。最新的一項(xiàng)研究表明，GnT-V 在約1/2 的非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)減少或丟失，但在非腫瘤性支氣管上皮細(xì)胞、支氣管腺細(xì)胞和肺泡肺細(xì)胞中正常表達(dá)。此外，GnT-V 低表達(dá)在鱗狀細(xì)胞癌中比在非鱗狀細(xì)胞癌中更常見，它與生存期縮短有關(guān)，是Ⅰ期切除非鱗狀細(xì)胞癌的不利預(yù)后因素。GnT-V 的表達(dá)減少可能通過某些靶糖蛋白β-1,6 分支寡糖的合成減少而改變非小細(xì)胞癌的生物學(xué)特性。

近年來，有文獻(xiàn)報道了肺癌血清、組織和細(xì)胞系中α1-抗胰蛋白酶（A1AT）糖基化的變化[7]。有研究應(yīng)用凝集素芯片檢測肺腺癌、鱗狀細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞癌和肺部良性疾病患者血清A1AT 糖基化的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，半乳糖化A1AT 可以區(qū)分非小細(xì)胞癌和肺良性疾??；巖藻糖基化A1AT 對肺腺癌與良性疾病或其他肺癌亞型的鑒別能力極強(qiáng)，含聚N-乙酰-D-乳糖胺的A1AT 可鑒別小細(xì)胞肺癌與良性疾病或非小細(xì)胞肺癌。此研究認(rèn)為，半乳糖基化A1AT、巖藻糖基化A1AT、含聚LacNAC 的A1AT 分別是診斷非小細(xì)胞癌、肺腺癌和小細(xì)胞癌最有希望的生物標(biāo)志物。

2.3 前列腺癌中蛋白質(zhì)糖基化的改變

前列腺癌（Prostate Cancer，PCa）是男性生殖系統(tǒng)最見的惡性腫瘤。血清前列腺特異抗原（Prostate Specific Antigen，PSA）是一個強(qiáng)大而廣泛的生物標(biāo)志物，盡管血清PSA 篩查結(jié)合直腸指檢和前列腺活檢標(biāo)本的格利森評分被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)用于前列腺癌的早期發(fā)現(xiàn)，但PSA 篩查的假陽性率極高，只有25%的病例被病理證實(shí)為前列腺癌，急需尋找一種新的可靠的方法來降低PSA 檢測的假陽性率。

格利森評分是目前最常用的預(yù)測PCa 預(yù)后的指標(biāo)。許多早期研究描述了N-糖基化譜的變化與PCa生物學(xué)的相關(guān)性，但并沒有描述聚糖結(jié)構(gòu)本身，而是觀察了糖蛋白水平的變化。例如，早期的一項(xiàng)研究[8]利用來自非侵襲性PCa 和侵襲性PCa 患者的OCT 包埋前列腺組織，并使用固相萃取方法富集N 糖，然后進(jìn)行質(zhì)譜（Mass Spectrometry，MS）分析。結(jié)果在侵襲性PCa 中發(fā)現(xiàn)軟骨寡聚基質(zhì)蛋白和骨膜蛋白的表達(dá)增加，血管黏附蛋白-1 的表達(dá)減少。在這項(xiàng)工作的基礎(chǔ)上，其同組展開了一項(xiàng)具有更廣泛患者樣本的后續(xù)研究，該研究[9]從正常前列腺、非侵襲性PCa、侵襲性PCa和轉(zhuǎn)移性PCa的組織中分離出N-連接糖肽，并用質(zhì)譜分析，每個樣本鑒定了1 430 個N-糖苷位點(diǎn)，其中220 個的顯著數(shù)量變化與PCa 進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)。其中，N-酰基乙醇胺酸?；负偷鞍桌野彼峒っ概c侵襲性PCa 顯著相關(guān)，這進(jìn)一步驗(yàn)證住院患者組織中這兩種標(biāo)志物對晚期疾病有高度預(yù)測作用。

2014 年，POWERS 等[10]利用MALDI-成像質(zhì)譜直接在人PCa 組織上分析聚糖，這種技術(shù)檢測到的聚糖能對應(yīng)到特定的組織區(qū)域。此研究分析了一個同時具有腫瘤和非腫瘤區(qū)域的人PCa 組織塊，發(fā)現(xiàn)與鄰近的良性腫瘤和間質(zhì)相比，高甘露糖聚糖在腫瘤區(qū)域特別明顯，而多個雙天線非唾液酸聚糖主要在非腫瘤區(qū)域檢測到。另有研究利用成像質(zhì)譜對包含138 例患者前列腺腫瘤組織和良性組織的組織微陣列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高甘露糖聚糖在腫瘤區(qū)域豐富，以及三天線和四天線聚糖隨著腫瘤級別的增加成比例增加[11]。在一項(xiàng)比較良性前列腺增生和PCa 患者血清的研究中發(fā)現(xiàn)，PCa 中核心巖藻糖基化雙天線聚糖和A2-3 唾液酸顯著增加，而含有外臂巖藻糖的三天線三半乳糖基化聚糖和四天線四亞?；厶秋@著減少[12]。

2.4 肝癌中蛋白質(zhì)糖基化的改變

糖型靶向生物標(biāo)志物最成功的例子是核心巖藻糖基化甲胎蛋白（Alpha Fetoprotein，AFP）在肝癌（Hepatic Carcinoma，HCC）診斷中的應(yīng)用。AFP 分泌過多不僅與肝癌有關(guān)，還與其他良性肝病如急性或慢性肝炎有關(guān)[13]。1981 年，有研究利用識別核心巖藻糖基化的小扁豆凝集素，確定了癌癥特異性AFP的微異質(zhì)性。巖藻糖基化AFP 通常從肝細(xì)胞釋放到膽汁中，而HCC患者血清巖藻糖基化的AFP水平升高。研究認(rèn)為，巖藻糖基化可能是肝臟糖蛋白分泌到膽汁中的分選信號，基于巖藻糖基化的分選機(jī)制在HCC中可能被破壞[14]。以小扁豆凝集素為基礎(chǔ)的檢測方法在臨床上的應(yīng)用已經(jīng)取得了進(jìn)展，并且AFP-L3 相對于總AFP 的比例被提出作為一種改進(jìn)的生物標(biāo)志物。AFP-L3 在鑒別肝癌、肝硬化和肝炎方面比AFP更適合作為預(yù)測指標(biāo)，因此，AFP-L3 被FDA 批準(zhǔn)為肝癌早期檢測的腫瘤生物標(biāo)志物，目前正在臨床應(yīng)用。即使AFP 水平低于截斷值，AFP-L3 也可用于HCC的早期檢測，并可用于治療后微小殘留病的檢測。

3 其他疾病中蛋白質(zhì)糖基化的改變

蛋白質(zhì)糖基化不僅對上述癌癥有診斷和預(yù)后的功能，還有望成為一些其他腫瘤和疾病的診斷標(biāo)志物。在腎臟中，N-聚糖在其過濾屏障的構(gòu)成和功能的維持起到了重要的作用。異常的蛋白質(zhì)N-糖基化與許多腎臟類疾病密切相關(guān)。在中國，IgA 腎病是最常見的原發(fā)性腎小球腎炎。有研究發(fā)現(xiàn)，IgA 與FcαR結(jié)合的增強(qiáng)是由于FcαRN58 位點(diǎn)唾液酸化的缺失，這可能成為IgA 腎病的發(fā)病機(jī)制之一[15]。在糖尿病腎病中，1 型糖尿病患者的蛋白尿中會出現(xiàn)異常巖藻糖基化的α-1-酸性糖蛋白的顯著增多以及三分支、四分支等復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)的增加和簡單二分支N-聚糖水平的降低，而在2 型糖尿病中特定單半乳糖化和α-2,6-唾液酸化水平是下降的。

在老年患者中，阿爾茨海默病（Alzheimer Disease，AD）等神經(jīng)退行性疾病是最常見的疾病，存在N-聚糖的改變。AD 患者的血液中炎癥介質(zhì)和促炎IgG Fc糖型水平升高，提示全身處于炎癥狀態(tài)，人們可以通過測定IgG Fc 糖基化的水平來監(jiān)測AD 的嚴(yán)重程度[16]。

4 結(jié)語

在許多癌癥和常見疾病的糖基化研究中，聚糖都有不同程度的改變，糖基化的異常有望用于疾病特異性癌癥診斷，成為預(yù)后生物標(biāo)志物。最新進(jìn)展的分析技術(shù)也能夠分析各種臨床樣本中目標(biāo)蛋白上的癌癥特異性糖型。盡管將糖基化生物標(biāo)志物候選物推進(jìn)到臨床試驗(yàn)還需要進(jìn)一步努力，但基于人工智能等分析平臺和診斷算法的進(jìn)步有望利用聚糖生物標(biāo)志物實(shí)現(xiàn)更精確的癌癥診斷。