王屹， 陳振波， 李勇， 王晶俏， 劉志忠

1. 中國(guó)康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院，a. 檢驗(yàn)科；b. 影像科，北京市 100068；2. 首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，北京市100068；3. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院放射科，北京市 100144

目的 觀察伴前庭水管擴(kuò)大(EⅤA)的非綜合征性聽力障礙(NSHI)患者耳聾基因突變譜。

方法 2015年10月至2016年8月，對(duì)湖北宜昌特殊教育學(xué)校確診為NSHI的患者85例進(jìn)行顳骨CT檢查，基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體DNA (mtDNA) 12S rRNA的20個(gè)耳聾相關(guān)基因突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果 顳骨CT顯示EⅤA患者31例。與非EⅤA患者相比，EⅤA患者攜帶突變的比例明顯增高(χ2 = 11.160, P =0.001)，主要表現(xiàn)為SLC26A4基因中c.919-2A＞G突變水平顯著增高(χ2 = 23.870, P ＜ 0.001)。

結(jié)論 伴EⅤA的NSHI患者耳聾基因突變譜不同于非EⅤA患者，可優(yōu)化耳聾基因檢測(cè)方案，為伴EⅤA的NSHI的早診斷、早干預(yù)提供幫助。

0 引言

聽力障礙是人類最常見的神經(jīng)感覺障礙，2015年，全球約有5億人患有聽力障礙，在所有殘疾因素中排名第4[1]，兒童發(fā)病率為1/1 000～1/300[2]，是全世界重大公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。中國(guó)2 800萬人存在聽力障礙，占?xì)埣踩丝倲?shù)的1/3。60%新生兒聽力障礙屬于遺傳性聽力障礙。遺傳性聽力障礙分為綜合征性聽力障礙和非綜合征性聽力障礙(nonsyndromic hearing impairment, NSHI)，越來越多的基因被證實(shí)與聽力障礙相關(guān)，截至2022年8月，確定的NSHI基因總數(shù)為124個(gè)[3-4]。NSHI僅表現(xiàn)為聽力不同程度損失，沒有其他身體癥狀，與中耳和/或內(nèi)耳的異常有關(guān)[5]。

前庭水管擴(kuò)大(enlarged vestibular aqueducts, EⅤA)患者聽力損害呈波動(dòng)性進(jìn)展，早期診斷、干預(yù)，是預(yù)防和推遲聽力損害的有效措施[6]。GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體DNA (mtDNA) 12S rRNA被認(rèn)為是中國(guó)NSHI最常見的致病基因[7-9]。對(duì)不同人群耳聾相關(guān)基因突變譜的研究發(fā)現(xiàn)，存在種族和地域的差異，同時(shí)也不斷發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)[10-11]，為NSHI的篩查提供大量數(shù)據(jù)支持[11-12]。目前關(guān)于顳骨CT異常的遺傳學(xué)研究已經(jīng)比較明確，EⅤA和/或Mondini發(fā)育不良與SLC26A4相關(guān)[5,13-16]。但也有部分研究未能在EⅤA患者中找到SLC26A4基因突變，我國(guó)伴EⅤA的NSHI耳聾基因突變譜的報(bào)道較少[17-19]。

本研究對(duì)NSHI患者分別進(jìn)行耳聾基因突變位點(diǎn)檢測(cè)和顳骨CT影像學(xué)分析，研究不同影像學(xué)表現(xiàn)NSHI患者的耳聾基因突變譜是否存在差異。

1 資料與方法

1.1 NSHI患者血液樣本收集

2015年10月至2016年8月，于湖北宜昌特殊教育學(xué)校選擇經(jīng)醫(yī)院確診為NSHI的患者85例。所有患者自愿加入本研究并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①明顯外耳、中耳畸形；②患有綜合征性聽力障礙相關(guān)的疾病，如視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良等。

采集患者全血樣本2 mL，乙二胺四乙酸二鈉抗凝，在-80 ℃保存。

本研究經(jīng)中國(guó)康復(fù)研究中心醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No. 2016-067-1)，所有患者均簽署知情同意書，符合《赫爾辛基宣言》的原則。

1.2 基因組DNA提取及多重聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)分析

本研究共檢測(cè)GJB2、GJB3、SLC26A4、mtDNA 12S rRNA 4個(gè)基因的20個(gè)位點(diǎn)。引物序列見表1。

表1 各基因突變位點(diǎn)及引物序列

采用DNA提取試劑盒(上海百奧科技有限公司)從全血樣本白細(xì)胞中提取基因組DNA。離心管加入蛋白酶K 20 μL、全血200 μL和緩沖液BL 200 μL，震蕩混勻15 s，56 ℃保溫10 min，加入無水乙醇200 μL震蕩混勻15 s，將混合液小心加入活化吸附柱中，12 000 r/min離心1 min，棄廢液。加入緩沖液BW1 500 μL，12 000 r/min離心1 min，棄廢液；加入緩沖液BW2 500 μL，12 000 r/min離心1 min，棄廢液。每次離心后更換收集管。加入洗脫液BE 60 μL，室溫(15 ℃～25 ℃)放置5 min，12 000 r/min離心1 min，洗脫收集基因組DNA。

多重PCR在微量滴定板孔中進(jìn)行，PCR混合物5 μL (10×PCR 緩 沖 液 含 20 mmol/L MgCl20.5 μL、25 mmol/L MgCl20.4 μL、 25 mmol/L dNTP mix 0.1 μL、0.5 μmol/L引物混合物 1 μL、5U/μL PCR 酶0.2 μL、DNA樣本2.8 μL)。95 ℃變性2 min，然后行45個(gè)擴(kuò)增循環(huán)：95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s和72 ℃延伸 60 s，最后72 ℃ 5 min。

每個(gè)反應(yīng)孔中加蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase, SAP)反應(yīng)混合緩沖液2 μL (HPLC級(jí)水1.53 μL、10× SAP 緩沖 液 0.17 μL、1.7 U/LSAP 酶0.30 μL)，輕輕混勻，瞬時(shí)離心后孵育。SAP反應(yīng)在37 ℃ 40 min和85 ℃ 5 min下進(jìn)行。

每個(gè)反應(yīng)孔加入iPLEX反應(yīng)混合物2 μL (HPLC級(jí) 水 0.619 μL、 0.222× iPLEX 緩 沖 液 0.2 μL、 1×iPLEX Termination mix 0.2 μL、0.84/1.04/1.57 μmol/L Extend Primer Mix 0.94 μL、1× iPLEX 酶 0.041 μL)，初始變性94 ℃ 30 min，然后行40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)：94 ℃變性5 s，52 ℃ 5 s和80 ℃ 5 s循環(huán)5次。樣品72 ℃孵育3 min。陽離子樹脂純化在多重PCR和iPLEX反應(yīng)中積累的鹽離子。

1.3 基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜突變分析

將多重PCR產(chǎn)物0.75 μL點(diǎn)樣在光譜芯片上，Sequenom MassARRAY〔毅新興業(yè)(北京)科技有限公司〕電離，MassARRAY TYPER 4.0軟件(美國(guó)AGENA BIOSCIENCE公司)分析，獲得樣本基因型。

1.4 高分辨率顳骨CT

所有患者采用Optima CT660 CT掃描儀(日本通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)有限公司)行標(biāo)準(zhǔn)顳骨掃描，峰值電壓120 kⅤ，電流100～300 mA，層厚0.625 mm，重建增加1mm，掃描視場(chǎng)20 cm，矩陣為512×512，高分辨率骨算法。前庭導(dǎo)水管中點(diǎn)寬度＞ 1.5 mm診斷為EⅤA[20]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用PRISM 6軟件(美國(guó)GRAPHPAD軟件公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以(±s)表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。顯著性水平α = 0.05。

2 結(jié)果

2.1 患者顳骨CT掃描

所有患者均為雙側(cè)聽力障礙。共檢出EⅤA患者31例，其中8例并發(fā)其他內(nèi)耳畸形；未發(fā)現(xiàn)EⅤA的患者54例中，14例存在其他內(nèi)耳畸形，40例未發(fā)現(xiàn)異常。

EⅤA-NSHI患者與非EⅤA-NSHI患者性別、年齡均無顯著性差異(P ＞ 0.05)。見表2。

表2 伴或不伴EVA的NSHI患者一般資料比較

2.2 耳聾基因突變位點(diǎn)

患者中未檢測(cè)到mtDNA 12S rRNA和GJB3基因突變。25例出現(xiàn)GJB2基因突變，18例出現(xiàn)SLC26A4基因突變。

EⅤA-NSHI患者中，9例未檢出突變基因位點(diǎn)。7例檢測(cè)到GJB2基因突變；15例檢測(cè)到SLC26A4基因突變。見表3。

表3 EVA-NSHI患者耳聾基因突變譜

非EⅤA-NSHI患者，34例未檢出基因位點(diǎn)突變。17例檢測(cè)到GJB2基因突變，3例檢測(cè)到SLC26A4基因突變。見表4。

表4 非EVA-NSHI患者耳聾基因突變譜

EⅤA-NSHI患者總突變率59.68%，明顯高于非EⅤA-NSHI患者的33.33% (P = 0.001)。其中，GJB2突變水平無顯著性差異(P ＞ 0.05)。EⅤA-NSHI患者SLC26A4的突變率顯著高于非EⅤA-NSHI患者(P ＜0.001)， 以 c.919-2A＞G 為 主要突 變點(diǎn)(P ＜ 0.001)。見表5。

表5 EVA-和非EVA-NSHI患者耳聾基因突變差異比較 單位：n

3 討論

有許多基因檢測(cè)方法可用于檢測(cè)患者基因多態(tài)性，如直接測(cè)序、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析和微陣列分析等，但由于分析方法復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，不適合大批量遺傳篩選[21-23]，基于質(zhì)譜的基因檢測(cè)由于其高通量，使多基因組合檢測(cè)大量遺傳篩查成為可能[23-24]。

GJB2、SLC26A4、GJB3和mtDNA 12S rRNA 4個(gè)耳聾基因的20個(gè)突變位點(diǎn)在中國(guó)聽力障礙患者的研究中獲得大量數(shù)據(jù)支持[23]。目前多基因組合檢測(cè)研究關(guān)注種族或地域差異[16,25-26]，雖然多種因素影響基因診斷敏感性[27]，僅50%左右患者能發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)，但多基因組合檢測(cè)仍然極大提高了診斷效率[23,28]。

EⅤA是兒童感音神經(jīng)性聽力損害最常見的內(nèi)耳畸形之一，表現(xiàn)為雙側(cè)或單側(cè)[29]。通過顳骨CT或MRI基本可以明確EⅤA診斷?；颊呗犃Ρ憩F(xiàn)為進(jìn)行性或波動(dòng)性下降，在發(fā)現(xiàn)聽力下降前常有感冒、輕微頭腦外傷或其他使顱內(nèi)壓增高的誘發(fā)因素。高通量顳骨CT有助于發(fā)現(xiàn)內(nèi)耳畸形，如Mondini畸形、Michel發(fā)育不全、EⅤA、內(nèi)耳道擴(kuò)張等[30-31]。本研究85例NSHI患者，顳骨CT檢出異常45例，其中31例(36.47%)表現(xiàn)為EⅤA，略高于國(guó)內(nèi)其他研究(11%～13%)[32]。

SLC26A4基因與EⅤA密切相關(guān)，純合突變和復(fù)合雜合突變均可導(dǎo)致耳聾。EⅤA患者存在多樣突變譜，本研究顯示，僅15例(48.38%)攜帶SLC26A4突變，7例攜帶GJB2突變，與Albert等[33]的結(jié)果相似，EⅤA患者中，40%攜帶SLC26A4突變。EⅤA患者SLC26A4突變水平較低的原因尚不清楚，推測(cè)有其他遺傳和環(huán)境因素參與其中。本研究中SLC26A4突變譜與中國(guó)人群相似，以c.919-2A＞G為熱點(diǎn)。丹麥EⅤA患者最常見的突變?yōu)?246A＞C[34]，表明EⅤA突變譜可能因人種不同而不同。

4 結(jié)論

本研究顯示，EⅤA-NSHI患者耳聾基因突變以SLC26A4的c.919-2A＞G為主，同時(shí)也存在一定GJB2基因突變。非EⅤA-NSHI患者耳聾基因突變以GJB2的235delC和SLC26A4的c.919-2A＞G為主。兩者間存在顯著差異，可為建立可靠、高效的NSHI篩查方法提供依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。