秦彥強， 董浩， 孫迎春， 程先寬， 姚海江

1. 中國康復研究中心北京博愛醫(yī)院中醫(yī)治療中心，北京市 100068；2. 首都醫(yī)科大學康復醫(yī)學院，北京市 100068；3.北京按摩醫(yī)院，北京市 100035

目的 探討不同針刺方案對卒中后抑郁(PSD)大鼠行為學、神經(jīng)遞質(zhì)及炎性相關(guān)因子的影響。

方法 健康雄性Sprague-Dawley大鼠72只，隨機分為正常組、模型組、藥物對照組、頭針組、腹針組和聯(lián)合針刺組，每組12只。模型組和各干預組采用Longa線栓法和慢性不可預知性溫和應激(CUMS)法復合制備PSD模型。藥物對照組予氟西汀灌胃，頭針組針刺百會、印堂穴，腹針組針刺中脘、關(guān)元穴，聯(lián)合針刺組針刺百會、印堂、中脘、關(guān)元穴，連續(xù)治療21 d。分別于實驗0 d (造模前)、7 d (CUMS前)、14 d (治療前)、35 d (治療后)進行Longa神經(jīng)功能缺損評分、體質(zhì)量、曠場試驗、糖水偏好實驗。實驗35 d采用ELISA法檢測血清5-羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)、干擾素-γ (INF-γ)、腫瘤壞死因子α (TNF-α)和巨噬細胞移動抑制因子(MIF)濃度。

結(jié)果 實驗35 d時，藥物對照組和聯(lián)合針刺組神經(jīng)功能缺損評分明顯低于模型組(P ＜ 0.01)，藥物對照組、腹針組、聯(lián)合針刺組體質(zhì)量明顯高于模型組(P ＜ 0.01)，藥物對照組、頭針組、腹針組、聯(lián)合針刺組水平跨格數(shù)、直立次數(shù)和糖水消耗量均高于模型組(P ＜ 0.05)；藥物對照組、頭針組、腹針組、聯(lián)合針刺組組間均無顯著性差異(P ＞ 0.05)。藥物對照組、頭針組、腹針組和聯(lián)合針刺組5-HT、DA、NE明顯高于模型組(P ＜ 0.01)，IFN-γ、TNF-α、MIF明顯低于模型組(P ＜ 0.01)。聯(lián)合針刺組5-HT高于頭針組和腹針組，IFN-γ、TNF-α、MIF明顯低于頭針組和腹針組(P ＜ 0.01)，DA、NE明顯高于腹針組(P ＜ 0.01)。

結(jié)論 頭針-腹針聯(lián)合針刺方案可以改善PSD大鼠行為學癥狀，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)，調(diào)控炎性因子，效果與氟西汀相似。單純使用頭針或腹針也有較好療效，可以作為次要選擇。

0 引言

腦卒中已經(jīng)成為全球第二大死因和第三大致殘原因[1]。據(jù)2019年統(tǒng)計，腦卒中已達到我國居民死亡原因的第3位[2]。卒中后抑郁(post-stroke depression,PSD)是卒中后最常見的神經(jīng)精神障礙，患病率約30%～50%[3]。PSD的病理生理學機制尚不明確[4]，選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitor, SSRI)被認為是首選治療方法[5]。SSRI有增加腦出血和其他副作用風險[6]。心理治療、行為療法、運動療法等也應用于PSD的康復[7]。

針刺對PSD有良好效果，且不良反應較少[8-10]，但作用機制尚不明確。本研究觀察不同針刺方案對PSD模型大鼠行為學指標、神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、多巴胺(dopamine, DA)、去甲腎上腺素(norepinephrine, NE)水平，以及炎性相關(guān)因子干擾素-γ (interferon-γ, INF-γ)、腫瘤壞死因子 α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)和巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)的影響，探討針刺對PSD的康復機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠72只，體質(zhì)量(200±20) g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物許可證號SCXK(京)2016-0006。適應性飼養(yǎng)于濕度40%～70%、室溫(24±2) ℃的實驗室1周，實驗室明暗光照12 h交替。

本研究對動物的處理嚴格遵守《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 主要實驗儀器及試劑

3111型CO2培養(yǎng)箱：美國FORMA公司。EXL800型酶標儀：美國BIO-TEK公司。KED-808I型電針儀：常州市武進長城醫(yī)療器械有限公司。TNF-α試劑盒(批號 1207180709)、 IFN-γ試 劑 盒 (批 號 1214180732)：RAYBIOTECH公司。5-HT試劑盒(批號20200630)、DA試劑盒(批號20200630)、NE試劑盒(批號20200630)：南京建成科技有限公司。鹽酸氟西汀分散片(批號8373A，20 mg/粒)：PATHEON FRANCE公司；禮來蘇州制藥有限公司分包裝。針灸針(直徑0.25 mm、長25 mm)：蘇州東邦醫(yī)療器械有限公司。尼龍栓線(2432-A4)：北京西濃科技有限公司。

1.3 模型制備

從72只大鼠選擇12只入正常組，造模成功的60只大鼠隨機分為模型組、藥物對照組、頭針組、腹針組和聯(lián)合針刺組，每組12只。

1.3.1 大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型

采用改良Longa線栓法[11]制備MCAO模型。大鼠術(shù)前禁食12 h，10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定。皮膚消毒，頸正中線右側(cè)0.5 cm切口，長約2 cm，暴露頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，分離血管及周圍神經(jīng)，注意動作輕柔，不可損傷局部微小血管及神經(jīng)。4-0號醫(yī)用非吸收縫合線結(jié)扎頸外動脈和頸總動脈近段，于頸總動脈結(jié)扎處與分叉處之間放置一打好結(jié)的絲線但不收緊。動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，于頸總動脈剪一小口，插入尼龍栓線，收緊備用絲線，松開動脈夾，調(diào)整線栓方向，避免插入翼腭動脈，經(jīng)頸內(nèi)動脈送入大腦前動脈。深度距頸總動脈分叉處18 mm左右、插入遇到阻力時，提示線栓到達大腦前動脈起始部，停止插入線栓。結(jié)扎備用絲線，剪掉多余絲線及線栓，逐層縫合。保溫復蘇90 min后，將栓線拔出至出現(xiàn)明顯阻力，剪掉露出皮膚外的栓線。動物清醒后左前肢無力，向左側(cè)方爬行，或朝左側(cè)轉(zhuǎn)圈爬行，且無煩躁不安，Longa評分[11]2～3分為造模成功。

1.3.2 PSD模型

MCAO模型成功大鼠采用孤養(yǎng)法結(jié)合慢性不可預知溫和刺激法(chronic unpredictable mild stimulation,CUMS)制備PSD大鼠模型。

MCAO術(shù)后穩(wěn)定1周。單籠飼養(yǎng)，共28 d，包括7種不同刺激，每天隨機選取1種刺激方案，同一刺激方案在7 d內(nèi)不重復出現(xiàn)。刺激方案包括傾斜鼠籠40° 24 h；墊料上灑水200 mL維持潮濕環(huán)境24 h；晝夜顛倒24 h；束縛大鼠2 h；將大鼠放入水平震蕩器中，以160 r/min高速震蕩30 min；大鼠放入自制的瓶中，漏出尾部，用自制夾夾住尾端3 cm處，持續(xù)1 min；禁食禁水24 h。

PSD模型成功標志：大鼠精神萎靡、各種活動減少、體質(zhì)量減輕、食量減少、拱背等，規(guī)定時間內(nèi)水平活動和垂直活動次數(shù)明顯減少，蔗糖水消耗量降低[12]。

1.4 干預方法

正常組、模型組不作任何干預。其他各組于UCMS開始7 d后給予干預，至UCMS結(jié)束。

藥物對照組每天予鹽酸氟西汀2.31 mg/kg灌胃。藥物溶于蒸餾水中，混勻，稍加熱，濃度約0.31 g/L。

頭針組參照《實驗針灸學》[13]取百會、印堂。百會位于頂骨正中，向前斜刺2 mm；印堂位于兩眼眶上緣最高點連線中點，向下平刺5 mm。針柄接電針儀，連續(xù)波，頻率2 Hz，電流強度以大鼠兩耳微微震動、無明顯煩躁為宜。每天30 min，連續(xù)治療21 d。

腹針組取中脘、關(guān)元。中脘位于臍上約20 mm，直刺2 mm；關(guān)元位于臍下約25 mm，直刺2 mm。電針方案同頭針組。

聯(lián)合針刺組同時選取百會、印堂、中脘、關(guān)元。電針方案同頭針組。

1.5 觀察指標

1.5.1 神經(jīng)功能缺損評分

分別于造模前(0 d)、CUMS前(7 d)、治療前(14 d)、治療后取材前(35 d)行Longa神經(jīng)功能缺損評分[11]。0分，無任何神經(jīng)功能損傷癥狀；1分，提拎尾部使大鼠身體離開地面，前爪不完全伸展；2分，大鼠行走時，左前肢肌力減弱，身體向左側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分，大鼠行走時，左前肢肌力減弱加重，身體向左側(cè)傾倒或無法行走；4分，大鼠意識喪失或昏迷，不能自發(fā)行走。

1.5.2 體質(zhì)量

1.5.3 曠場實驗

分別于實驗0 d、7 d、14 d、35 d進行曠場實驗。100×100×50 cm木質(zhì)敞箱，底面和四周均為黑色，無蓋，底面劃分為16個25×25 cm的小方格。大鼠置于敞箱中心，觀察3 min內(nèi)活動情況，以穿越地面方塊數(shù)作為水平運動得分，后肢直立次數(shù)作為垂直運動得分。

1.5.4 糖水試驗

分別于實驗0 d、7 d、14 d、35 d行糖水消耗試驗。大鼠禁食水8 h后，予蒸餾水和2%蔗糖水各1瓶，約500 mL，24 h后調(diào)換水的位置并對2瓶水稱重。

1.5.5 組織取材與指標檢測

行為學指標檢測結(jié)束后，每組隨機選取6只，1%戊巴比妥鈉4 mL/kg腹腔注射麻醉，取腹主動脈血5 mL裝瓶備用并標記。動脈血靜置2 h，冷凍離心機4 ℃、3000 r/min、半徑10 cm離心15 min，取上清液-80 ℃冰箱保存。

ELISA試劑盒檢測大鼠血清5-HT、DA、NE、INF-γ、TNF-α和MIF含量。按說明書操作，37 °C避光溫育10～15 min后，加入終止液終止反應，10 min內(nèi)在450 nm測量各孔光密度值，繪制標準曲線，查出其濃度。

小學數(shù)學教學情境的創(chuàng)設，要符合不同年齡段兒童的心理特點和認知規(guī)律，要根據(jù)不同的教學內(nèi)容有所變化。多年來，通過參加課題研究和教學實踐，從在新課引入時、在新知的探究中、在知識鞏固上、在整個課堂教學中創(chuàng)設不同的情境，我探索了一些方法，并取得了一些收獲：

1.6 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 25.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)兩兩比較采用LSD檢驗，不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)兩兩比較采用Dunnett's T3檢驗。顯著性水平α = 0.05。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分

實驗7 d時，除正常組外，各組評分均為2分，MCAO模型制備成功。14 d時，除正常組外，各組仍為2分，不進行統(tǒng)計分析。35 d時，藥物對照組與聯(lián)合針刺組評分較模型組明顯降低(P ＜ 0.01)。見圖1。

2.2 體質(zhì)量

實驗0 d時，各組體質(zhì)量無顯著性差異(P ＞ 0.05)。實驗7 d、14 d、35 d時，模型組、藥物對照組、頭針組、腹針組、聯(lián)合針刺組體質(zhì)量均明顯低于正常組(P ＜ 0.01)。實驗35 d時，藥物對照組、腹針組、聯(lián)合針刺組體質(zhì)量較模型組明顯升高(P ＜ 0.01)，4個干預組大鼠體質(zhì)量無顯著性差異(P ＞ 0.05)。見圖1。

2.3 曠場實驗

實驗0 d時，各組水平跨格數(shù)與直立次數(shù)無顯著性差異(P ＞ 0.05)。7 d、14 d、35 d時，模型組、藥物對照組、頭針組、腹針組、聯(lián)合針刺組大鼠水平跨格數(shù)和直立次數(shù)均明顯低于正常組(P ＜ 0.01)。35 d時，藥物對照組、頭針組、腹針組、聯(lián)合針刺組大鼠水平跨格數(shù)和直立次數(shù)均明顯高于模型組(P ＜ 0.01)；4個干預組之間無顯著性差異(P ＞ 0.05)。見圖1。

2.4 糖水試驗

實驗0 d時，各組糖水消耗量無顯著性差異(P ＞0.05)。7 d、14 d、35 d時，模型組、藥物對照組、頭針組、腹針組、聯(lián)合針刺組糖水消耗量明顯低于正常組(P ＜ 0.01)。35 d時，藥物對照組、頭針組、聯(lián)合針刺組大鼠糖水消耗量均高于模型組(P ＜ 0.05)；4個干預組之間無顯著性差異(P ＞ 0.05)。見圖1。

圖1 各組神經(jīng)功能評分、體質(zhì)量、曠場試驗和糖水試驗比較

2.5 5-HT、DA、NE

模型組、藥物對照組、頭針組、腹針組、聯(lián)合針刺組血清5-HT、DA、NE水平均明顯低于正常組(P ＜0.01)。35 d時，藥物對照組、頭針組、腹針組和聯(lián)合針刺組5-HT、DA、NE水平均明顯高于模型組(P ＜ 0.01)。

聯(lián)合針刺組5-HT水平與藥物對照組無顯著性差異(P ＞ 0.05)，頭針組和腹針組5-HT水平明顯低于聯(lián)合針刺組(P ＜ 0.01)。

頭針組與聯(lián)合針刺組大鼠DA水平與藥物對照組無顯著性差異(P ＞ 0.05)，腹針組DA水平明顯低于聯(lián)合針刺組(P ＜ 0.01)。

3個針刺治療組NE水平明顯低于藥物對照組(P ＜0.01)，聯(lián)合針刺組NE水平明顯高于腹針組(P ＜ 0.01)。

見表1。

表1 各組5-HT、DA、NE比較 單位：pg/mL

2.6 炎性相關(guān)因子

模型組、藥物對照組、頭針組、腹針組、聯(lián)合針刺組血清IFN-γ、TNF-α、MIF水平均明顯高于正常組(P ＜ 0.01)；藥物對照組、頭針組、腹針組和聯(lián)合針刺組IFN-γ、TNF-α、MIF水平均明顯低于模型組(P ＜ 0.01)。

頭針組、腹針組和聯(lián)合針刺組IFN-γ水平均與藥物對照組相當(P ＞ 0.05)，聯(lián)合針刺組明顯優(yōu)于頭針組和腹針組(P ＜ 0.01)。

聯(lián)合針刺組與藥物對照組TNF-α和MIF水平相當(P ＞ 0.05)，聯(lián)合針刺組優(yōu)于頭針組和腹針組(P ＜ 0.05)。

見表2。

表2 各組IFN-γ、TNF-α、MIF比較 單位：pg/mL

3 討論

PSD不僅嚴重影響患者康復進程和生活質(zhì)量[15]，更嚴重影響工作能力。腦卒中后重返工作崗位的比率在不同國家為7%～75%，腦卒中后1年內(nèi)的中位數(shù)約為53%[16]。較低的返崗率會嚴重影響患者的幸福感和生活滿意度[17-18]，加重抑郁情緒。尋求有效安全、患者接受度高的PSD康復方案，成為臨床主要任務。

中醫(yī)康復可安全有效改善PSD[19]。由于醫(yī)學的發(fā)展，嚴重腦損傷后開顱手術(shù)的介入，致使針刺治療在頭部取穴時受到影響。

我們嘗試開發(fā)一種在頭針應用受限時的替代治療方案。因此本研究分別使用頭針(百會、印堂)、腹針(中脘、關(guān)元)治療和頭腹針(百會、印堂、中脘、關(guān)元)聯(lián)合的方案，評價各方案對PSD大鼠行為學、單胺類遞質(zhì)及炎性相關(guān)因子的影響。

通過預實驗及文獻研究[20-21]發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中后進行孤養(yǎng)并給予CUMS，有利于獲得更可靠的PSD模型。目前，SSRI是國內(nèi)外公認的用于治療PSD的臨床一線藥物。鹽酸氟西汀能夠選擇性抑制5-HT轉(zhuǎn)運體，阻斷突觸前膜對5-HT的再攝取，使體內(nèi)5-HT保持較高含量，延長和增加5-HT的作用，從而產(chǎn)生抗抑郁作用，常用于抗抑郁研究[22]。本研究應用鹽酸氟西汀作為療效對照，分析不同治療方案對PSD大鼠血清5-HT、DA、NE的影響，觀察不同治療方案對PSD的療效。研究發(fā)現(xiàn)，治療后，4種治療方法均對PSD模型大鼠有效；各治療組之間療效無顯著性差異，提示頭針、腹針或聯(lián)合應用頭、腹針，均有類似藥物治療的作用，與既往研究結(jié)果相似[23-25]。

與PSD密切相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)主要以單胺類神經(jīng)遞質(zhì)為主[26]。5-HT、DA、NE等可反映單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的活性；5-HT、DA、NE缺乏可導致5-HT受體功能受限，神經(jīng)遞質(zhì)功能受損，引起抑郁癥狀[27]。本研究顯示，給予藥物、頭針、腹針和聯(lián)合針刺治療均可以提高大鼠血清中5-HT、DA、NE的水平，聯(lián)合針刺組5-HT水平與藥物對照組相當，頭針組和聯(lián)合針刺組DA水平與藥物對照組相當。

腦卒中可激活炎性應答系統(tǒng)，引起炎性細胞因子異常，在神經(jīng)遞質(zhì)合成代謝及免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[28]。在PSD發(fā)病機制中，Th細胞因子分泌失衡占有重要地位。IFN-γ屬Th1型細胞因子，其異常表達與PSD的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[29-30]。針刺可以糾正PSD患者炎性因子水平紊亂，降低PSD患者血清中IFN-γ水平，調(diào)節(jié)神經(jīng)功能[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，4種治療均可以降低IFN-γ水平，且頭針、腹針或者聯(lián)合針刺治療對IFN-γ的影響均與藥物治療相當；聯(lián)合針刺組優(yōu)于頭針組和腹針組。

TNF-α、IL-1β和其他細胞因子可誘導5-HT轉(zhuǎn)運體和NE轉(zhuǎn)運體的過度表達，導致抑郁樣行為[32]。PSD患者血清中TNF-α水平較高[33]，可作為腦卒中患者是否會發(fā)生抑郁的預測指標[34]。本研究顯示，PSD大鼠血清中TNF-α水平最高，4種治療均可以降低TNF-α水平。聯(lián)合針刺與藥物治療對TNF-α調(diào)控作用相當，均優(yōu)于頭針或腹針治療。

MIF是先天免疫和炎癥反應的中心細胞因子，一直被認定為促炎因子[35]。MIF可能通過IFN-γ對多巴胺代謝的影響，導致抑郁樣癥狀的產(chǎn)生；MIF水平升高與未來3個月PSD風險增加相關(guān)[36-38]。本研究發(fā)現(xiàn)，PSD大鼠血清中MIF水平升高，4種治療均可以降低MIF水平；聯(lián)合針刺治療與藥物治療對MIF水平調(diào)控作用相當，均優(yōu)于單純頭針或單純腹針治療。

4 結(jié)論

頭針結(jié)合腹針的聯(lián)合針刺方案，不論在改善PSD大鼠行為學方面，還是調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)領域，以及在PSD相關(guān)炎性因子調(diào)控方面，均與藥物氟西汀作用相當，可作為改善PSD預后的可靠選擇。在頭腹針不能同時使用時，僅使用頭針或腹針依然具有較好療效，可以作為次要選擇。頭針結(jié)合腹針的聯(lián)合針刺方案調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)及炎性因子的機制尚不明確，需要進一步深入研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。