張 峰，王守英，韓金紅，李 軍

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院泌尿外科，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院管理學院，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

各種先天性和獲得性的泌尿生殖系統(tǒng)異常、男性副腺感染、陰囊溫度升高、內(nèi)分泌紊亂、遺傳因素和免疫因素等均可影響男性生育能力[1]，其中炎癥和感染是最主要的因素[2]。已有越來越多的病原體被證明能影響精子運動能力和功能，如大腸埃希菌、淋球菌、支原體、衣原體等[2]。納米細菌最早由芬蘭科學家Kajander等在培養(yǎng)哺乳動物細胞時發(fā)現(xiàn)，形態(tài)微小，可通過 0.22 μm 除菌濾器，常規(guī)細菌培養(yǎng)方法難以生長，需在細胞培養(yǎng)基中才能生長[3]。目前，納米細菌已被證實與泌尿系結(jié)石、鈣化性疾病密切相關(guān)[4-6]，而且能在體外對多種細胞產(chǎn)生毒性作用[7-8]。ZHOU等[9]成功從Ⅲ型前列腺炎患者前列腺液中分離培養(yǎng)出納米細菌。隨后，SHEN等[10]研究表明，納米細菌可能是Ⅲ型前列腺炎的致病因素。因為前列腺液是精液的重要組成部分，所以推測存在于前列腺炎尤其是Ⅲ型前列腺炎患者體內(nèi)的納米細菌可對患者精子產(chǎn)生影響而導致患者不育。ZHANG等[11]從睪丸微石癥的不育患者精液中分離出納米細菌，提示納米細菌可能與微石癥患者的不育有關(guān)。LIN等[12]用納米細菌成功誘導大鼠生精小管管腔形成睪丸微石，并提出納米細菌可致睪丸組織出現(xiàn)病變。基于此，本研究將從Ⅲ型前列腺炎患者的前列腺液標本中分離培養(yǎng)納米細菌，并將納米細菌體外感染人精子細胞，利用計算機輔助精子分析系統(tǒng)(computer-assisted sperm analysis，CASA)分析納米細菌體外對人精子運動參數(shù)的影響，探討納米細菌對人精子細胞的影響，從而為一些不明原因的不育癥患者提供新的診療思路。

1 資料與方法

1.1 標本來源選擇 2021年10～12月新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院泌尿外科收治的12例Ⅲ型前列腺炎患者為納米細菌標本來源對象。病例納入標準：(1)符合Ⅲ型前列腺炎的診斷標準[13]；(2)首診發(fā)現(xiàn)；(3)前列腺炎癥狀持續(xù)3個月以上；(4)年齡29～33歲；(5)具有完整的臨床相關(guān)資料。病例排除標準：(1)合并急性前列腺炎、前列腺增生、前列腺腫瘤、泌尿系結(jié)石、尿路感染等疾病；(2)合并心、腦血管疾病；(3)合并肝、腎功能不全等疾病。同時選擇 2021年11月至2022年1月于新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院生殖男科體檢的10名無泌尿生殖系統(tǒng)疾病的健康青年男性為精子來源對象。本研究已獲新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(批準文號：K2021-018-01號)，研究過程中嚴格遵守倫理學相關(guān)要求，保護患者隱私；所收精液標本均為體檢后剩余標本，故已申請豁免患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 納米細菌的培養(yǎng)參照KAJANDER等[3]和SHEN等[10]的方法，收集Ⅲ型前列腺炎患者的前列腺液標本，置于無菌杯中，無菌生理鹽水對倍稀釋前列腺液，充分震蕩混勻后，依次用0.45 μm和0.22 μm 除菌濾器過濾，加入含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于含體積分數(shù)5%二氧化碳的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2周換液1次，培養(yǎng)4～6周，觀察結(jié)果；同時設(shè)不加標本的培養(yǎng)基作為陰性對照。

1.2.2 納米細菌的茜素紅染色將“1.2.1”項中培養(yǎng)的納米細菌菌液4 ℃下14 000×g離心 30 min，棄上清，下層沉淀用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)重懸，然后，4 ℃下14 000×g離心5 min，重復3次，取下層沉淀涂在載玻片上。按照茜素紅染色試劑盒說明書和李永國等[14]報道方法對細菌進行茜素紅鈣染色：將涂有細菌的玻片自然晾干后用體積分數(shù)95%乙醇和乙醚(二者比例為11)固定15 min，蒸餾水沖洗后置于70 ℃恒溫烤箱中烤片，使細菌更好固定于玻片上，10 min后，小心加入適量染液覆蓋在菌膜上，室溫下孵育5 min，然后用蒸餾水沖洗，晾干后鏡下觀察并拍照，參照文獻[14-15]中的標準：以白色沉淀形式存在于培養(yǎng)管底部，且為微小顆粒，常聚集成簇，茜素紅鈣染色呈深紅色判斷納米細菌。根據(jù)染色結(jié)果將患者分為納米細菌陰性組和納米細菌陽性組。

1.2.3 CASA系統(tǒng)分析納米細菌陰性組和納米細菌陽性組患者的精子特征應(yīng)用CASA系統(tǒng)分析2組患者的精液量、精子濃度、總活力、前向運動力。

1.2.4 納米細菌懸液的制備將“1.2.1”項中的納米細菌菌液4 ℃下14 000×g離心30 min，棄上清，下層沉淀用無菌生理鹽水清洗后，4 ℃下14 000×g離心5 min，重復3次，然后用無菌生理鹽水將菌液濃度調(diào)至2麥氏備用。

1.2.5 精子懸液的制備10名健康男性禁欲3 d，手淫法采集精液，置于無菌容器中，液化精液，并經(jīng)上游法優(yōu)化處理，使前向運動精子百分比達50%以上、精子活率80%以上后，再用輸卵管液調(diào)節(jié)精子濃度為70×109L-1后備用。

1.2.6 納米細菌體外感染精子細胞取精子懸液隨機分為對照組和實驗組。對照組和實驗組分別用輸卵管液、納米細菌懸液各100 μL與等體積精子懸液充分混勻，接種于細胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃恒溫水浴箱中孵育。

1.2.7 CASA系統(tǒng)分析實驗組和對照組的精子形態(tài)和運動能力分別于孵育0、2、4、8 h時，采用CASA系統(tǒng)分析2組精子形態(tài)、凝集情況、精子數(shù)量和精子運動能力，每份標本觀測10～15個視野。主要觀測指標包括：精子形態(tài)和凝集現(xiàn)象、精子濃度、總活力、前向運動力、直線速度(velocity straight linear，VSL)、曲線速度(velocity curve linear，VCL)、平均路徑速度(velocity average path，VAP)和精子頭部側(cè)擺幅度(amplitude of lateral head displacement，ALH)。

2 結(jié)果

2.1 納米細菌培養(yǎng)結(jié)果結(jié)果見圖1。培養(yǎng)的納米細菌為沉積在管底的白色沉淀，且培養(yǎng)基顏色變黃；陰性標本顏色與培養(yǎng)基對照組相比，顏色略有變黃。

A：前列腺液標本中納米細菌陽性培養(yǎng)結(jié)果；B：前列腺液標本中納米細菌陰性培養(yǎng)結(jié)果；C：陰性對照培養(yǎng)結(jié)果。

2.2 納米細菌茜素紅染色結(jié)果結(jié)果見圖2。茜素紅染色結(jié)果顯示，不同視野下的納米細菌常聚集成簇，單個細菌由于形體微小不可見，成簇的納米細菌可被染成紅色。12例Ⅲ型前列腺炎患者的前列腺液標本中，5例判斷含有納米細菌，7例判斷未含有納米細菌。

A、B、C、D、E分別為5份前列腺液標本納米細菌培養(yǎng)陽性染色結(jié)果，成簇的納米細菌可被染成紅色。

2.3 納米細菌陰性組與納米細菌陽性組Ⅲ型前列腺炎患者的臨床特征比較結(jié)果見表1。納米細菌陰性組與納米細菌陽性組患者的年齡、精液量、總活力比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；納米細菌陽性組患者的精子濃度、前向運動力顯著低于納米細菌陰性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

表1 納米細菌陰性組與納米細菌陽性組Ⅲ型前列腺炎患者的相關(guān)臨床資料比較

2.4 實驗組和對照組精子形態(tài)和凝集情況比較結(jié)果見圖3。顯微鏡下，2組精子形態(tài)各時間點無明顯變化，均未出現(xiàn)明顯凝集。

圖3 實驗組和對照組精子不同孵育時間點形態(tài)(×400)

2.5 對照組和實驗組精子濃度比較結(jié)果見表2。2組精子濃度隨孵育時間的延長呈下降趨勢(F=132.925、135.420，P<0.001)。孵育0 h時，對照組和實驗組精子濃度比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；孵育2、4、8 h時，實驗組精子濃度顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

表2 對照組和實驗組體外孵育不同時間點精子濃度比較

2.6 對照組和實驗組體外孵育不同時間點精子運動參數(shù)的比較結(jié)果見表3。對照組精子總活力、前向運動力、VCL、VSL、VAP及ALH隨著孵育時間的延長呈下降趨勢(F=304.494、48.012、95.780、53.538、383.257、287.428，P<0.001)，且實驗組精子總活力、前向運動力、VCL、VSL、VAP及ALH隨著孵育時間的延長亦呈下降趨勢(F=1 758.057、924.174、297.114、244.244、1 173.730、290.031，P<0.001)。孵育0 h時，對照組和實驗組精子總活力、前向運動力、VCL、VSL、VAP及ALH比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；孵育2、4、8 h時，實驗組精子總活力、前向運動力、VCL、VSL、VAP及ALH 顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 對照組和實驗組體外孵育不同時間后運動參數(shù)的比較

3 討論

許多病原體可導致男性生殖系統(tǒng)感染，進而影響精子的生成以及精子運動參數(shù)，損害患者的生殖能力[16]。其中細菌性感染在眾多病原體中的檢出率較高，納米細菌這一特殊的納米級微生物也被證實與男性泌尿生殖系統(tǒng)感染密切相關(guān)，尤其是結(jié)石患者，甚至還會在患者體內(nèi)形成生物膜從而影響治療效果[17-18]。納米細菌不易在普通細菌培養(yǎng)環(huán)境中生長，依賴于細胞培養(yǎng)環(huán)境，白色培養(yǎng)物易黏附于管底，這是納米細菌培養(yǎng)成功的一個重要的微生物學特征；其次是納米細菌在培養(yǎng)過程中能產(chǎn)生羥基磷灰石礦化外殼，可通過鈣染色進行鑒定；且鈣染色特異性較高，假陽性率較低，可作為鑒別納米細菌的重要參考指標[14]。本研究結(jié)果顯示，對Ⅲ型前列腺炎患者的前列腺液標本培養(yǎng)后管底有白色沉淀，且培養(yǎng)基顏色變黃；陰性標本顏色與培養(yǎng)基對照組相比，顏色也略有變黃；茜素紅鈣染色結(jié)果顯示，不同視野下有紅色染色細菌；這證明，本研究參照文獻方法成功分離培養(yǎng)出納米細菌。

本研究結(jié)果顯示，納米細菌陽性組患者的精子濃度、前向運動力顯著低于納米細菌陰性組，這提示納米細菌可對Ⅲ型前列腺炎患者精子細胞產(chǎn)生影響。此外，本研究體外將納米細菌與精子共孵育后，精子濃度、精子總活力、前向運動力、VCL、VSL、VAP及ALH隨孵育時間的延長呈下降的趨勢；納米細菌與精子共孵育2、4、8 h時，精子濃度、精子總活力、前向運動力、VCL、VSL、VAP及ALH顯著低于對照組。因為共孵育8 h后，對照組精子濃度和活力已不符合推薦參考值范圍；所以，本研究未對后續(xù)時間點數(shù)據(jù)進行展示。另外，由于納米細菌本身生長緩慢，可以忽略在共孵育過程中因納米細菌增殖導致營養(yǎng)消耗、菌液與精子比例不一致等因素帶來的干擾。因此，以上研究結(jié)果證實，納米細菌可在體外降低精子濃度及各運動參數(shù)。推測納米細菌產(chǎn)生細胞毒性作用的機制如下：(1)納米細菌感染靶細胞后，納米細菌的羥基磷灰石礦化外殼可能會直接損傷細胞[10]；(2)納米細菌產(chǎn)生的脂多糖樣內(nèi)毒素也可能會對靶細胞產(chǎn)生毒性作用[19]；(3)納米細菌也可作為外來物質(zhì)激活靶細胞溶酶體酶，誘導活性氧系統(tǒng)的活化，最終導致細胞凋亡、自噬[8,20]；(4)納米細菌感染機體后除了細菌對靶細胞的直接作用外，也能誘導免疫細胞產(chǎn)生細胞因子間接導致機體靶細胞損傷。SHEN等[10]通過納米細菌感染SD大鼠誘導前列腺組織炎癥模型，從模型大鼠前列腺組織中檢出了較高水平的白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α；而白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α會對精子數(shù)量和精子參數(shù)產(chǎn)生不利的影響[21]。然而，這些是否是納米細菌對精子產(chǎn)生不利影響的機制仍需進一步驗證。

細菌對精子的黏附是導致精子聚集和活力下降的原因之一。決定黏附作用的物質(zhì)既包括細菌自身成分也包括精子細胞膜上的成分，二者相互作用導致精子黏附和聚集，如大腸桿菌、支原體、葡萄球菌等[2]。本研究結(jié)果顯示，顯微鏡下，對照組和實驗組精子形態(tài)各時間點無明顯變化，均未出現(xiàn)明顯的聚集與黏附，推測這可能與納米細菌的特殊性有關(guān)；考慮到精子濃度呈顯著下降趨勢，推測納米細菌對精子的影響更趨向于毒性損傷而非黏附，因為精子細胞的完整性同樣也能影響精子活力[22]。

綜上所述，納米細菌可降低精子濃度和運動參數(shù)，進而可能影響患者的生育能力。由于納米細菌生長周期較長、培養(yǎng)條件異于常規(guī)培養(yǎng)方式，故很容易被忽略；因此，對于不育男性患者應(yīng)綜合考慮各種感染性因素。考慮納米細菌對精子的影響更趨向于毒性損傷而非黏附，需進一步探討納米細菌對精子毒性作用的機制。