季 禾，栗延偉，譚 軍，曹武璟，張振祥

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三臨床學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453003;3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

急性缺血性卒中(acute ischemic stroke，AIS)是以突然起病、迅速出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙為特征的一類(lèi)腦血管病，發(fā)病率較高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2010年至2019年，我國(guó)AIS的發(fā)病率從129/10萬(wàn)上升至145/10萬(wàn)[1]。AIS具有高致殘率、高致死率的特點(diǎn)，患者即使得到及時(shí)治療，也常因缺血、壞死等腦組織損傷而引起語(yǔ)言和肢體功能障礙。盡早開(kāi)始再灌注治療，挽救缺血半暗帶以減輕腦缺血時(shí)腦損傷程度是AIS治療的關(guān)鍵。國(guó)際指南廣泛推薦的有效的再灌注治療措施有急性期應(yīng)用靜脈溶栓及血管內(nèi)介入治療等措施[2-3]。但是，在恢復(fù)腦循環(huán)灌注時(shí)不可避免地會(huì)對(duì)腦組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生進(jìn)一步損害，影響大腦功能，即腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)，因此，尋找一種減輕CIRI的有效措施對(duì)于腦缺血性卒中的治療極為重要[4-5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)作為CIRI的重要機(jī)制可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6-7]。CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer binding protein homologous protein，CHOP)是ERS的經(jīng)典標(biāo)志物，也是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵點(diǎn)[8]。腺苷是一種神經(jīng)保護(hù)劑，有研究顯示，腺苷激動(dòng)劑可通過(guò)抑制ERS減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷[9]。劉超等[10]研究顯示，腺苷激動(dòng)劑可降低CHOP的表達(dá)，減輕大鼠心肌ERS，從而抑制細(xì)胞凋亡?；诖耍狙芯坑^察腺苷預(yù)處理(adenosine preconditioning，AP)對(duì)大鼠CIRI后CHOP表達(dá)和ERS的影響，探討腺苷對(duì)CIRI的保護(hù)作用和機(jī)制，以期為預(yù)防AIS后CIRI提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30只健康成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量250～280 g。大鼠單籠飼養(yǎng)在鼠房?jī)?nèi)，給予自由飲水和充足的食物，并保持鼠房良好的通風(fēng)、適宜的溫度和濕度及明暗周期均衡的光線。

1.2 主要試劑與儀器大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型栓線購(gòu)自北京西濃科技有限公司，水合氯醛購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，腺苷購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染料、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TdT mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)細(xì)胞凋亡熒光檢測(cè)試劑盒以及蛋白酶K購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，CHOP抗體購(gòu)自美國(guó)Signalway Antibody(SAB)有限公司，兔鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶(streptavidin peroxidase，SP)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，CHOP引物由廣州如期生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，mRNA 提取試劑(RNAiso Plus)、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Master Mix)購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒(PowerUp SYBR Green Master Mix)購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；qRT-PCR儀購(gòu)自美國(guó)Thermofisher公司，冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)HERMLE公司，全波長(zhǎng)讀數(shù)儀購(gòu)自上海徠卡儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及預(yù)處理按隨機(jī)數(shù)字表法將36只健康雄性SD大鼠分為假手術(shù)組、缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)組和AP組，每組12只。術(shù)前各組大鼠禁食12 h、禁水2 h。AP組大鼠腹腔注射腺苷注射液(1.5 mg·kg-1，生理鹽水稀釋至2 mL，術(shù)前3 d，每日1次)；假手術(shù)組和IR組大鼠在相同時(shí)間和地點(diǎn)腹腔注射2 mL生理鹽水(術(shù)前 3 d，每日1次)。

1.3.2 大鼠MCAO及CIRI模型制備IR 組和 AP 組大鼠參考LONGA等[11]的方法制備MCAO模型：2組大鼠腹腔注射100 g·L-1水合氯醛溶液(3 mL·kg-1)麻醉，固定大鼠四肢于專(zhuān)用手術(shù)臺(tái)并始終保持大鼠仰躺姿勢(shì)狀態(tài)，備皮、碘伏消毒頸部皮膚，鋪洞巾，頸部正中偏左約0.5 cm處做縱向手術(shù)切口，鈍性分離筋膜、肌肉及神經(jīng)，結(jié)扎左側(cè)頸外動(dòng)脈及左側(cè)頸總動(dòng)脈，并在頸總動(dòng)脈上剪一小口，輕輕插入MCAO栓線至頸內(nèi)動(dòng)脈，深度18～20 mm，縫合皮膚，碘伏消毒傷口，栓線固定于胸前皮膚。栓塞2 h后，向外拔栓線約1 cm制備CIRI模型。假手術(shù)組大鼠不插入栓線，余處理同IR組及AP組。

1.3.3 大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分3組大鼠蘇醒后，按照5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[12]對(duì)3組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，1～3分為有效模型；0、4分或死亡為無(wú)效模型，剔除術(shù)中因栓線插入過(guò)深致蛛網(wǎng)膜下腔出血的大鼠、麻醉藥物個(gè)體差異等原因所致死亡的大鼠及無(wú)效MCAO模型大鼠，隨時(shí)補(bǔ)充各組大鼠，以保證每組MCAO模型大鼠的數(shù)量一致；評(píng)分后單籠飼養(yǎng)于條件良好穩(wěn)定的鼠房?jī)?nèi)，給予充足的食物和水。

1.3.4 組織取材和標(biāo)本制備隨機(jī)選取每組大鼠各6只，于再灌注24 h后腹腔注射100 g·L-1水合氯醛溶液(3 mL·kg-1)進(jìn)行麻醉，麻醉成功后開(kāi)胸經(jīng)心臟快速灌注生理鹽水200 mL后再灌注40 g·L-1多聚甲醛200 mL；將灌注后的大鼠快速斷頭取腦，冠狀切取視交叉前后各 2 mm 腦組織，置于40 g·L-1多聚甲醛溶液中固定 24 h，脫水、透明、固定，石蠟包埋，使用切片機(jī)制備腦組織切片(厚度約5 μm)，用于HE染色、免疫組織化學(xué)染色及TUNEL染色。各組余下的6只大鼠于再灌注24 h后迅速斷頭取腦，新鮮腦組織保持于-80 ℃冰箱中，用于qRT-PCR檢測(cè)。

1.3.5 HE染色觀察腦組織形態(tài)石蠟切片于烤片機(jī)上65 ℃烤片2 h，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇(下行梯度100%、95%、85%、75%)脫二甲苯，流水沖洗，行蘇木精染色，鹽酸酒精分化、伊紅染色，再經(jīng)梯度乙醇(上行梯度75%、85%、95%、100%)脫水，二甲苯透明處理后中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察大鼠腦組織病理學(xué)變化。

1.3.6 qRT-PCR法檢測(cè)腦組織中CHOP mRNA的表達(dá)取-80 ℃冰箱中冷存腦組織，應(yīng)用TRIzol法提取總mRNA，應(yīng)用全波長(zhǎng)讀數(shù)儀測(cè)波長(zhǎng)260 nm和280 nm處的吸光度(absorbence,A)值，并選取A260/A280值在1.8～2.1之間的樣本測(cè)定其濃度。按PrimeScript RT Master Mix cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，反應(yīng)條件：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)37 ℃ 15 min，反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng) 85 ℃ 5 s，4 ℃ 維持。按PowerUp SYBR Green Master Mix qRT-qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行定量檢測(cè)，以β-actin為參照。反應(yīng)條件：UDG 酶激活 50 ℃ 2 min，預(yù)變性95 ℃ 2 min，95 ℃ 變性1 s，60 ℃ 退火/延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。CHOP mRNA上游引物序列為5′-TGTTGAAGATGAGCGGGTGG-3′，下游引物序列為5′-TGGACCGGTTTCTGCTTTCA-3′；β-actin上游引物序列為5′-TCAGCAAGCAGGAGTACGATG-3′，下游引物序列為5′-GTGTAAAACGCAGCTCAGTAACA-3′。檢測(cè)熒光信號(hào)，獲得相應(yīng) Ct 值，應(yīng)用2-△△Ct法計(jì)算CHOP mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.7 SP法檢測(cè)大鼠腦組織中CHOP蛋白表達(dá)取各組大鼠腦組織石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、下行梯度乙醇脫二甲苯、水洗及磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗、高壓鍋內(nèi)抗原修復(fù)；滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑室溫孵育20 min，滴加山羊血清室溫封閉 30 min，再滴加CHOP一抗(滴度1100)，4 ℃冰箱過(guò)夜；然后，滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔 IgG 聚合物室溫孵育 20 min，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉標(biāo)記卵白素工作液室溫孵育 20 min；滴加二氨基聯(lián)苯胺液染色，纖維鏡下觀察至細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕黃色，自來(lái)水沖洗終止染色；蘇木精復(fù)染 1 min，鹽酸乙醇分化數(shù)秒后再經(jīng)上行梯度乙醇脫水，二甲苯透明后封片。顯微鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)呈黃色或棕黃色者為 CHOP蛋白陽(yáng)性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取 5 個(gè)不重疊高倍視野(×400)采集圖像，應(yīng)用Image J 圖像分析軟件計(jì)算CHOP蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率。CHOP蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率=CHOP蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.8 TUNEL法檢測(cè)大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的情況取各組大鼠腦組織石蠟切片，在烤片機(jī)上烤片30 min，溫度設(shè)置在65 ℃；二甲苯脫蠟2次、梯度乙醇(下行梯度為100%、90%、70%)脫二甲苯3次，水洗后滴加Tris-HCl(pH=7.4)稀釋的不含DNase的蛋白酶K，室溫下孵育30 min，PBS洗滌3次，充分洗去蛋白酶K；然后，滴加TUNEL檢測(cè)液，37 ℃避光孵育60 min，PBS充分洗滌3次后用抗熒光淬滅封片液封片，避光下用熒光顯微鏡(×200)觀察，每張切片選取3個(gè)不重疊高倍視野(×400)采集圖像，應(yīng)用Image J 圖像分析軟件計(jì)算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較假手術(shù)組、IR 組和AP組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分分別為(0.000±0.000)、(2.889±0.272)、(1.167±0.408)分，3組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=157.923，P<0.05)；IR 組和AP組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.663、7.133，P<0.05)；AP組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著低于IR 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-10.530，P<0.05)。

2.2 3組大鼠腦組織病理學(xué)表現(xiàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核完整，間質(zhì)無(wú)水腫；IR組大鼠腦組織神經(jīng)元數(shù)目減少、細(xì)胞核溶解、出現(xiàn)空泡，間質(zhì)水腫，組織疏松；AP組大鼠神經(jīng)元損傷程度低于IR組。

A：假手術(shù)組；B：IR 組；C：AP組。

2.3 3組大鼠腦組織中CHOP mRNA相對(duì)表達(dá)量比較假手術(shù)組、IR 組和AP組大鼠腦組織中CHOP mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.000±0.000、3.850±0.091、1.881±0.067。3組大鼠腦組織中CHOP mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2 989.751，P<0.05)；IR組和AP組大鼠腦組織中CHOP mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=75.514、23.502，P<0.05)；AP組大鼠腦組織中CHOP mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于IR 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-52.171，P<0.05)。

2.4 3組大鼠腦組織中CHOP蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)比較結(jié)果見(jiàn)圖2。CHOP蛋白在細(xì)胞質(zhì)中呈黃色或棕黃色。IR 組和AP組大鼠腦組織中CHOP 蛋白陽(yáng)性細(xì)胞較假手術(shù)組顯著增多，AP組大鼠腦組織中CHOP 蛋白陽(yáng)性細(xì)胞顯著少于IR 組。假手術(shù)組、IR 組和AP組大鼠腦組織中CHOP 蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率分別為(0.767±0.505)%、(21.650±3.442)%、(7.654±1.199)%。3組大鼠腦組織中CHOP 蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2 257.096，P<0.05)；IR組和AP組大鼠腦組織中CHOP 蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=65.927、21.744，P<0.05)；AP組大鼠腦組織中CHOP 蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率顯著低于IR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-44.183，P<0.05)。

A：假手術(shù)組；B：IR 組；C：AP組。

2.5 3組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況比較結(jié)果見(jiàn)圖3。假手術(shù)組、IR 組和AP組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率分別為(0.063±0.137)%、(18.565±2.232)%、(9.104±2.030)%。3組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 519.372，P<0.05)；IR組和AP組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.512、2.693，P<0.05)；AP組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率顯著低于IR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.818，P<0.05)。

A：假手術(shù)組；B：IR 組；C：AP組。

3 討論

1977年HEARSE[13]首次提出組織及器官在低灌注缺血后恢復(fù)血流灌注可進(jìn)一步加重組織及器官的損傷。腦缺血再灌注期間可產(chǎn)生一系列復(fù)雜的生化代謝、生理功能、病理形態(tài)改變等，其機(jī)制復(fù)雜，包括炎癥反應(yīng)、興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、能量代謝障礙、自由基損傷和細(xì)胞凋亡等多種機(jī)制。腺苷作為一種神經(jīng)調(diào)節(jié)劑，其對(duì)CIRI的保護(hù)作用已被證實(shí)[14]。在腦組織缺血缺氧情況下，腺苷由低濃度生成和代謝平衡狀態(tài)，快速調(diào)整為高濃度狀態(tài)而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。腺苷的主要神經(jīng)保護(hù)機(jī)制有：抑制鈣離子內(nèi)流，減少興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放，阻止NO合成；抑制炎癥細(xì)胞黏附和浸潤(rùn)，減輕炎癥細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞損傷；抑制血小板的聚集，擴(kuò)張腦血管；抑制自由基產(chǎn)生，減輕自由基介導(dǎo)的再灌注損傷；降低缺血后神經(jīng)元的能量消耗，增加能量供應(yīng)[15]。本研究結(jié)果顯示，IR 組和AP組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯高于假手術(shù)組，AP組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯低于IR 組。假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核完整，間質(zhì)無(wú)水腫；IR組大鼠腦組織神經(jīng)元數(shù)目減少、細(xì)胞核溶解、出現(xiàn)空泡，間質(zhì)水腫，組織疏松；AP組大鼠神經(jīng)元損傷程度較IR組顯著減輕。IR組和AP組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率顯著高于假手術(shù)組，AP組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率顯著低于IR組。以上研究結(jié)果提示，腺苷可通過(guò)降低腦組織細(xì)胞凋亡來(lái)改善CIRI。

細(xì)胞凋亡除有死亡受體途徑、線粒體途徑，還有ERS[16]。合成、加工及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白需在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)這一重要細(xì)胞器中進(jìn)行，缺血缺氧會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，誘導(dǎo)一些未折疊的蛋白及錯(cuò)誤折疊的蛋白，這些錯(cuò)誤蛋白聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)從而影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常生理功能，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。細(xì)胞對(duì)未折疊的蛋白及錯(cuò)誤折疊的蛋白做出的應(yīng)對(duì)反應(yīng)為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)。UPR主要通過(guò)激活3種跨膜蛋白的激活發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，分別是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜應(yīng)激傳感器蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶、肌醇需要酶、激活轉(zhuǎn)錄因子6，這3種跨膜蛋白均可激活CHOP的表達(dá)[17]。CHOP在生理狀態(tài)下以很低的表達(dá)水平存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)ERS發(fā)生時(shí)其表達(dá)量顯著增加。CHOP為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)促凋亡蛋白，是ERS啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的重要位點(diǎn)。研究表明，柚皮甙[16]、大黃酚[18]等藥物預(yù)處理及低溫預(yù)處理[19]、電針預(yù)處理[20]等方法可通過(guò)抑制CHOP表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕CIRI。本研究結(jié)果顯示，IR組和AP組大鼠腦組織中CHOP mRNA相對(duì)表達(dá)量和CHOP 蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率顯著高于假手術(shù)組，AP組大鼠腦組織中CHOP mRNA相對(duì)表達(dá)量和CHOP 蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率顯著低于IR 組，這說(shuō)明，腦缺血再灌注可使大鼠腦組織CHOP mRNA及CHOP蛋白的表達(dá)量顯著升高，而AP使大鼠腦組織CHOP mRNA及CHOP蛋白的表達(dá)量顯著降低，提示腺苷改善CIRI可能與其抑制CHOP的表達(dá)有關(guān)。推測(cè)其機(jī)制可能是：正常生理狀態(tài)下ESR未被啟動(dòng)，CHOP未被激活，處于靜息狀態(tài)；當(dāng)細(xì)胞發(fā)生缺血再灌注時(shí)，細(xì)胞為應(yīng)對(duì)ERS出現(xiàn)未折疊蛋白反應(yīng)，從而激活CHOP，使CHOP呈高表達(dá)狀態(tài)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，造成腦組織損傷，出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀；AP使CHOP的表達(dá)降低，從而減輕細(xì)胞凋亡程度，改善腦組織損傷及神經(jīng)功能缺損癥狀。

綜上所述，腺苷可能通過(guò)抑制CHOP的表達(dá)，抑制ESR，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，從而減輕CIRI，發(fā)揮腦保護(hù)作用；這為腺苷的神經(jīng)保護(hù)作用提供新的支持點(diǎn)，為AIS后CIRI的治療提供新的治療依據(jù)。