龐麗 宋昊躍 王春迪 趙薛紅 安慧敏 庫園冉 王彩芳 張建夫 葛紅蓮 張福麗

摘要：對哈茨木霉T-aloe促進(jìn)小麥生長和防治小麥赤霉病的潛能進(jìn)行分析，并對其液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。通過平板對峙試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，T-aloe能夠抑制小麥赤霉病原菌PH-1生長，抑菌率為72.38%。通過溫室試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，T-aloe可以促進(jìn)小麥幼苗生長，提高小麥的抗病性。在無小麥赤霉病菌脅迫下，T-aloe提高小麥幼苗的株高、根長和葉片含水量，其中葉片含水量提高1.01倍，株高和根長分別提高16.7%和16.2%。在小麥赤霉病菌脅迫下，T-aloe提高小麥體內(nèi)抗氧化酶POD和CAT活性28.17%和39.33%，同時降低了MDA和游離脯氨酸含量34.26%和25.71%。通過田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，T-aloe對小麥赤霉病的防治效果達(dá)到了68.42%，且高于陽性對照[XCZ1.tif]霉靈。通過正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，糖蜜-酵母膏培養(yǎng)基為T-aloe液體發(fā)酵產(chǎn)孢的最優(yōu)培養(yǎng)基，最佳培養(yǎng)基條件為：培養(yǎng)溫度32 ℃、接種量5%、轉(zhuǎn)速 180 r/min，產(chǎn)孢量可達(dá)1.82×108 CFU/mL，比優(yōu)化前提高64.91%。綜上所述，哈茨木霉T-aloe是1株既能促進(jìn)小麥生長又能防治小麥赤霉病的優(yōu)勢菌株。為了哈茨木霉T-aloe進(jìn)一步商業(yè)化應(yīng)用，對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高哈茨木霉T-aloe的產(chǎn)孢量，為哈茨木霉T-aloe的應(yīng)用提供理論依據(jù)和奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：哈茨木霉；生物防治；小麥赤霉病；液體發(fā)酵；產(chǎn)孢量；培養(yǎng)基優(yōu)化

中圖分類號：S435.121.4+5? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）23-0132-08

小麥（Triticum aestivum L.）是全球三大谷物之一，種植面積大且分面范圍最為廣泛，也是我國重要的經(jīng)濟(jì)糧和儲藏糧，并在國民經(jīng)濟(jì)中起著重要作用［1］。小麥赤霉病是由多種鐮刀菌引起的小麥重要病害，其中由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）引起的尤為嚴(yán)重。近年來，由于全球氣候變暖、氣溫升高，很多地方尤其是高溫、高濕地區(qū)的小麥赤霉病流行成災(zāi)，危害程度不斷加深［2］。在我國，小麥赤霉病一般發(fā)生在長江中下游和淮河以南地區(qū)，這種病害一般可導(dǎo)致小麥產(chǎn)量損失10%～30%，重災(zāi)時可達(dá)70%，甚至顆粒無收［3］。小麥赤霉病除造成小麥減產(chǎn)外，還會在小麥感病籽粒里產(chǎn)生多種鐮刀菌毒素，如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA）。人類和牲畜一旦誤食了含有這些毒素的小麥，就會產(chǎn)生一系列的中毒反應(yīng)，嚴(yán)重時甚至死亡［4］。

目前，人們通常使用化學(xué)防治、生物防治和農(nóng)業(yè)防治等手段防治小麥赤霉病，主要以化學(xué)防治為主。但是隨著化學(xué)農(nóng)藥的過量使用，病原菌株的抗藥性不斷增強(qiáng)，使化學(xué)農(nóng)藥防效逐漸降低［5］。近年來，生物制劑開始逐漸替代化學(xué)農(nóng)藥，成為農(nóng)作物病害管理的重要措施，同時解決了化學(xué)殺菌劑對其他非目標(biāo)生物產(chǎn)生的不利影響［6］。木霉（Trichoderma spp.）作為重要的生防真菌，可以快速生長、產(chǎn)孢并在植物根系定殖，提高植物抵抗非生物和病原菌脅迫的能力，促進(jìn)根系以及整個植株的生長發(fā)育［7］。另外，很多木霉菌也具有直接拮抗或抑制植物病原菌生長的功能。同時，由于木霉對人類、動物以及其他有益生物無不良影響，不會對自然環(huán)境產(chǎn)生威脅，也不會在食物鏈中積累，因此具有巨大的作為商業(yè)生防制劑的潛力［8］。

在木霉應(yīng)用的過程中，生長速度、產(chǎn)孢量和產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物都直接影響木霉的生防效率［9］。因此，在開發(fā)木霉生物制劑的過程中，必須考慮影響木霉生長和產(chǎn)孢的各種參數(shù)因素，如溫度、pH值、溶氧量和培養(yǎng)基等［10］。這些因素影響孢子萌發(fā)、菌絲生長、產(chǎn)孢以及木霉次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量［11］。目前，木霉的發(fā)酵方式主要有2種：液體發(fā)酵和固體發(fā)酵。較固體發(fā)酵而言，液體發(fā)酵被廣泛應(yīng)用于木霉產(chǎn)孢、次級代謝產(chǎn)物以及多種水解酶的生產(chǎn)［12-13］。本研究將哈茨木霉菌株T-aloe在小麥上進(jìn)行應(yīng)用，分析其促進(jìn)小麥生長和防治小麥赤霉病的潛能，并對T-aloe液體培養(yǎng)基發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為木霉T-aloe生防制劑開發(fā)和廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和培養(yǎng)基

供試木霉菌株：哈茨木霉（T. harzianum） T-aloe，由周口師范學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離并保存，GenBank登錄號為KC753766。禾谷鐮刀菌 PH-1，由周口師范學(xué)院植物遺傳與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室羅奇博士提供。供試小麥品種為周麥36。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基［14］：去皮馬鈴薯200 g/L，葡萄糖 20 g/L。綠豆培養(yǎng)基［20］：綠豆 60 g/L，煮沸過濾。葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基［15］：葡萄糖20 g/L，KH2PO4? 1.2 g/L，MgSO4·H2O? 0.6 g/L，維生素B1 0.008 g/L。玉米粉-酵母膏培養(yǎng)基［16］：玉米粉1.01%，酵母膏0.47%，（NH4）2SO4? 0.05%，K2HPO4? 0.06%，MgSO4·7H2O? 0.05%，pH值5.79。糖蜜-酵母膏培養(yǎng)基［17］：糖蜜20 g/L，酵母膏 5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O? 0.1 g/L，MgSO4·7H2O? 1.25 g/L，KH2PO4? 4.0 g/L，NaNO3? 7 g/L。

1.2 菌株活化和菌液制備

菌株活化：將-80 ℃保藏的木霉T-aloe和病原菌PH-1取出，吸取0.1 mL，用涂布器分別涂布于PDA培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。木霉菌株 T-aloe 發(fā)酵液的制備：在平板上刮取少量已活化的木霉菌絲接種于含有PDA培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min 搖床培養(yǎng)7 d。T-aloe種子液的制備：在超凈工作臺中，用4層無菌紗布將T-aloe發(fā)酵液進(jìn)行過濾，過濾液即為種子液，將其放置4 ℃冰箱備用。病原菌PH-1孢子懸浮液的制備：在平板上刮取少量已活化的病原菌菌絲接種于綠豆培養(yǎng)基中，于28 ℃、220 r/min搖床上培養(yǎng)5 d。

1.3 木霉菌株T-aloe有益特性分析

1.3.1 哈茨木霉T-aloe與小麥病原禾谷鐮刀菌PH-1對峙培養(yǎng) 25 mL PDA培養(yǎng)基倒入直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中，待凝固后，在PDA培養(yǎng)基的兩邊接種直徑為8 mm的木霉T-aloe菌餅和病原菌PH-1的菌餅，以只接種8 mm PH-1的PDA平板為對照，每組3個重復(fù)，于28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，每天觀察并測量木霉和病原菌的生長半徑并拍照記錄，計(jì)算抑菌率。

1.3.2 哈茨木霉T-aloe對小麥幼苗的促生作用 將哈茨木霉T-aloe發(fā)酵液，稀釋成孢子濃度為 1×107 CFU/mL的溶液。將小麥種子用45 ℃的溫水浸泡 3 h，然后均勻播種在花盆中，每盆20粒，在25 ℃的溫室中培養(yǎng)5 d后，用T-aloe發(fā)酵液灌根處理幼苗，同時對照用PDB處理，每盆30 mL。待 7 d 后測量小麥幼苗的株高、根長、根數(shù)、含水量以及小麥的葉綠素含量［18］。

1.3.3 哈茨木霉T-aloe誘導(dǎo)小麥抗病性生理指標(biāo)的測定 試驗(yàn)共設(shè)4個處理：對照組（CK）；病原菌組（F）；哈茨木霉T-aloe組（T）；哈茨木霉T-aloe加病原菌組（T+F）。挑選籽粒飽滿的小麥種子，45 ℃水浴3 h，然后將小麥種子放置在方形小盒（7 cm×7 cm）中，待小麥幼苗長至10 cm后，分別用30 mL PDB和濃度為3.1×107 CFU/mL的T-aloe 發(fā)酵液灌根處理，處理2 d后對幼苗進(jìn)行病麥粒接種，接種方法參照王路瑤的方法［21］。病麥粒接種的第4、6天，對小麥幼苗的抗性酶活性及受損傷程度進(jìn)行檢測，主要對POD活性、CAT活性、MDA含量和游離的脯氨酸含量進(jìn)行測定，測定方法均采用李萍等的方法［19］。

1.3.4 哈茨木霉T-aloe對小麥大田赤霉病的防治效果 本試驗(yàn)于2022年4月在河南省周口市周口師范學(xué)院試驗(yàn)田（33°6′N，114°6′E）中進(jìn)行，小區(qū)長10 m，寬 3 m，面積為30 m2。在小麥揚(yáng)花初期，將清水、250 mg/L霉靈和1×107 CFU/mL哈茨木霉T-aloe發(fā)酵液分別等量均勻地噴灑在小麥麥穗部并套袋保濕，24 h后再噴灑病原菌PH-1（1×105 CFU/mL），PH-1連續(xù)噴3 d，頻率為1次/d，每次噴灑完后立即套袋保濕。其中清水為空白對照，霉靈為陽性對照。每種處理3組重復(fù)，每個重復(fù)取25個麥穗，分別在病原菌處理后的第10、20天統(tǒng)計(jì)小麥麥穗的發(fā)病情況，病情分級標(biāo)準(zhǔn)、病情指數(shù)和防效計(jì)算公式參考王路遙的方法［20］。

1.4 哈茨木霉T-aloe發(fā)酵條件優(yōu)化

主要對不同培養(yǎng)基、溫度、接種量以及轉(zhuǎn)速進(jìn)行篩選。

培養(yǎng)基：分別用PDB培養(yǎng)基、葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基、玉米粉-酵母膏培養(yǎng)基、糖蜜-酵母膏培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基。從4 ℃冰箱取出T-aloe種子液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，最后用無菌水將T-aloe種子液稀釋成濃度為 2×107 CFU/mL，按1%的接種量接種，每250 mL錐形瓶裝液量為100 mL，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)8 d，每隔24 h進(jìn)行計(jì)數(shù)，每種培養(yǎng)基3個重復(fù)。

溫度：設(shè)置25、28、31、34、37 ℃等5個溫度梯度。

接種量：設(shè)置2%、5%、8%、12%、15%等5個接種量。

轉(zhuǎn)速：設(shè)置120、150、180、210 r/min等4個轉(zhuǎn)速梯度。

1.5 正交試驗(yàn)

前期試驗(yàn)已經(jīng)篩選出哈茨木霉T-aloe產(chǎn)孢的最適培養(yǎng)基為糖蜜-酵母膏培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基確定的條件下對溫度、轉(zhuǎn)速和接種量進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)，其中因素A為溫度，因素B為接種量，因素C為轉(zhuǎn)速，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

1.6 哈茨木霉T-aloe產(chǎn)孢量測定

用XB-K-25型血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。菌懸液用蒸餾水適當(dāng)稀釋后，4層紗布過濾，搖勻，取樣，加入到血球計(jì)數(shù)板內(nèi)，靜置5 min，遵循“計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右”的原則，對計(jì)數(shù)池的左上、右上、左下、右下及中間進(jìn)行計(jì)數(shù)。產(chǎn)孢量的計(jì)算公式如下：

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表制作。采用SPSS 25.0進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 哈茨木霉T-aloe防治小麥赤霉病的潛能分析

2.1.1 哈茨木霉T-aloe抑制了小麥病原禾谷鐮刀菌PH-1生長 哈茨木霉T-aloe與禾谷鐮刀菌PH-1對峙培養(yǎng)結(jié)果如圖1所示，培養(yǎng)后第7天，T-aloe 菌落已占據(jù)整個生存空間，覆蓋了整個病原菌落，并產(chǎn)生了大量的綠色孢子，T-aloe 抑制了病原菌PH-1的生長，抑制率為72.38%；同時還發(fā)現(xiàn)，對峙培養(yǎng)時，T-aloe 影響病原菌的色素分泌，這可能是因?yàn)門-aloe降低了病原菌PH-1的毒性。

2.1.2 哈茨木霉T-aloe對小麥幼苗生長的促進(jìn)作用 哈茨木霉T-aloe促進(jìn)了小麥幼苗的生長。T-aloe處理小麥幼苗7 d后，小麥幼苗長勢如圖 2-a 所示，株高明顯高于對照植株。另外，小麥幼苗葉部的含水量（圖2-b）、株高（圖2-e）以及根長（圖2-d）均顯著高于對照。與對照相比，葉部含水量提高1.01倍（圖2-a），株高和根長分別增加16.7%和16.2%。根部含水量（圖2-b）、葉綠素含量（圖2-c）和根數(shù)（圖2-e）與對照無明顯差異。

2.1.3 哈茨木霉T-aloe誘導(dǎo)了小麥幼苗抗病性提高 接種病原菌第6天，研究了哈茨木霉T-aloe對小麥幼苗抗病性提高的誘導(dǎo)作用（圖3）。接種病原菌第6天，T組的MDA含量與CK組無顯著差異，而T+F組的MDA含量比CK+F組低34.26%（圖3-a）。 說明小麥?zhǔn)艿讲≡{迫時， T-aloe 可以緩解膜脂過氧化造成的細(xì)胞損傷。脯氨酸是植物在逆境環(huán)境下產(chǎn)生的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。在病原菌處理的第6天，CK+F組比CK組的脯氨酸含量增加41.14%，T+F組、T組與CK組脯氨酸含量三者之間無明顯差異，但與CK+F組之間均差異顯著（P<0.05），其中T+F組脯氨酸含量比CK+F低25.71%（圖3-b）。說明在病原脅迫條件下T-aloe可以降低脯氨酸的含量，由此推測T-aloe可以保護(hù)植物使其免受病原菌的侵害。植物在逆境環(huán)境下，會產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），而POD和CAT可以清除ROS，降低ROS引起的細(xì)胞損傷，提高植物的防御性。在無病原菌脅迫條件下，T組POD活性相比于CK組上升26.89%，而T組CAT活性與CK組無明顯差異。在病原菌脅迫條件下，T+F組POD和CAT活性分別比CK+F組上升28.17%和39.33%（圖3-c、圖3-d）。說明在病原菌脅迫條件下，T-aloe可以提高POD和CAT活性，清除過量的ROS，在提高小麥抗病性中起重要作用。綜上所述，哈茨木霉T-aloe可以通過清除ROS，在病原脅迫下降低膜脂過氧化來提高小麥幼苗的抗病性。

2.1.4 哈茨木霉T-aloe對小麥赤霉病的田間防治效果 與陰性對照清水和陽性對照霉靈相比，哈茨木霉T-aloe處理明顯減輕了小麥赤霉病的發(fā)生（表3、圖4）。接種病原菌后第10、20天，T-aloe處理過的小麥病情指數(shù)均低于陽性對照霉靈組，且二者之間具有顯著差異（P<0.05）。T-aloe 處理組的防效在接種病原菌后第10、20天分別為68.42%和32.65%，均高于霉靈組（分別為36.84%和17.35%），分別提高85.72%和88.18%。

2.2 哈茨木霉T-aloe發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 不同培養(yǎng)基對哈茨木霉T-aloe產(chǎn)孢的影響

不同培養(yǎng)基對哈茨木霉T-aloe產(chǎn)孢的影響如圖5所示。T-aloe在4種培養(yǎng)基中均能產(chǎn)生孢子，其中以糖蜜-酵母膏培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量最大，其次是PDB培養(yǎng)基、玉米粉-酵母膏培養(yǎng)基和葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基。不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)時，T-aloe最大產(chǎn)孢量出現(xiàn)的時間不同，在PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)96 h時產(chǎn)孢量最大，為8.19×107 CFU/mL（圖5-a），在糖蜜-酵母膏培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h時，產(chǎn)孢量最大，為 1.34×108 CFU/mL（圖5-d），而在葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基和玉米粉-酵母膏培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，產(chǎn)孢量最大，分別為9.67×104、3.83×106 CFU/mL（圖5-b、圖5-c），24 h后孢子數(shù)量呈下降趨勢。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)部分孢子已經(jīng)開始萌發(fā)產(chǎn)生菌絲，但是葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基和玉米粉-酵母膏培養(yǎng)基卻無法誘導(dǎo)菌絲產(chǎn)生孢子，所以在72 h后產(chǎn)孢量基本沒有發(fā)生明顯的變化。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，以培養(yǎng)時間 72 h、PDB培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，T-aloe在糖蜜-酵母膏培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量比PDB培養(yǎng)基提高109.70%；T-aloe 在葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基、玉米粉-酵母膏培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量分別比PDB降低99.91%、99.45%。因此，本試驗(yàn)選擇糖蜜-酵母膏作為培養(yǎng)基進(jìn)一步研究不同溫度、接種量、轉(zhuǎn)速對哈茨木霉T-aloe產(chǎn)孢的影響，并于72 h分別進(jìn)行取樣。

2.2.2 溫度、接種量和轉(zhuǎn)速對哈茨木霉T-aloe產(chǎn)孢的影響 在糖蜜-酵母膏培養(yǎng)基中，不同溫度對哈茨木霉T-aloe產(chǎn)孢量的影響如圖6-a所示。T-aloe 在不同溫度下均可生長，其產(chǎn)孢量隨著溫度的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。其中，31 ℃時，T-aloe 的產(chǎn)孢量最大，可達(dá)1.747×108 CFU/mL。在糖蜜-酵母膏培養(yǎng)基中，不同接種量對哈茨木霉T-aloe產(chǎn)孢的結(jié)果如圖6-b所示，接種量對T-aloe的產(chǎn)孢量有顯著影響（P<0.05）。當(dāng)接種量為5%時，T-aloe的產(chǎn)孢量最高，可達(dá)1.623×108 CFU/mL。在糖蜜-酵母膏培養(yǎng)基中，不同轉(zhuǎn)速對哈茨木霉T-aloe產(chǎn)孢量仍具有顯著性影響（P<0.05）（圖6-c），隨著轉(zhuǎn)速的增加，T-aloe的產(chǎn)孢量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min時，T-aloe的產(chǎn)孢量最高，可達(dá)1.32×108 CFU/mL?？傊囵B(yǎng)溫度31 ℃、接種量5%、轉(zhuǎn)速180 r/min是哈茨木霉發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)孢的較優(yōu)條件。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化各因素對哈茨木霉T-aloe發(fā)酵產(chǎn)孢的影響

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，溫度、接種量、轉(zhuǎn)速對哈茨木霉T-aloe的產(chǎn)孢量均具有顯著性影響，為篩選出T-aloe發(fā)酵的最佳培養(yǎng)條件，對溫度、接種量、轉(zhuǎn)速進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)（表2）。正交試驗(yàn)結(jié)果如表4所示，由極差R的大小可知，溫度、接種量、轉(zhuǎn)速對T-aloe產(chǎn)孢量的影響從大到小依次為轉(zhuǎn)速>溫度>接種量，即C>A>B，3個因素的最佳組合為A3B2C2，由此得到T-aloe最佳培養(yǎng)條件為：溫度32 ℃、接種量5%、轉(zhuǎn)速180 r/min。在此條件下培養(yǎng)哈茨木霉 T-aloe，產(chǎn)孢量達(dá)到1.82×108 CFU/mL，比糖蜜-酵母膏培養(yǎng)基（培養(yǎng)72 h、溫度28 ℃、接種量1%、轉(zhuǎn)速180 r/min）產(chǎn)孢量提高35.82%；比PDB培養(yǎng)基（培養(yǎng)72 h、溫度28 ℃、接種量1%、轉(zhuǎn)速 180 r/min）產(chǎn)孢量提高184.99%。

3 結(jié)論與討論

木霉是重要的植物生防菌之一，它可以通過競爭、重寄生和分泌抗生性的次級代謝產(chǎn)物來拮抗多種植物病原菌［21］。競爭作用是木霉的一種重要的拮抗機(jī)制，木霉在與病原微生物的對峙過程中，可以迅速生長產(chǎn)孢占領(lǐng)營養(yǎng)和生存空間［22］。本研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉T-aloe可以通過迅速占領(lǐng)空間的競爭作用來抑制小麥赤霉病菌禾谷鐮刀菌PH-1的生長，抑菌率可達(dá)72.38%（圖1）。

另外，木霉可以和植物建立共生關(guān)系，定殖在植物根系表皮細(xì)胞，刺激植物激素和防御化合物的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)多種農(nóng)作物的生長，如大豆、小麥、番茄和蘿卜等［23］。Joshi等發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉可以提高辣椒和黃瓜幼苗的生長，株高、葉面積、植株干質(zhì)量以及葉綠素含量均有所提高［24］。本研究中哈茨木霉T-aloe提高了小麥幼苗的株高、根長及葉片含水量（圖2），說明T-aloe可以促進(jìn)小麥幼苗生長。

禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病是我國重要的小麥流行性病害之一［25］。在病原菌脅迫條件下，木霉可以降低病原菌的侵染能力，提高植物的防御酶活性，進(jìn)而提高植物的抗病能力［26］。植物在受到病原侵害時，會產(chǎn)生大量的O-2·和H2O2等活性氧（ROS）來抵御和殺死病原菌，但是過量的ROS會引發(fā)細(xì)胞的膜脂過氧化，加重植物的受損傷程度［27］。其中，MDA含量是反映細(xì)胞膜脂過氧化和細(xì)胞損傷程度的重要指標(biāo)，植物受損傷程度越大，MDA含量就越高［28］。除此之外，脯氨酸的積累量也可以反映植物的受脅迫程度，脯氨酸作為主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，既可以降低細(xì)胞的酸性，也可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的內(nèi)滲透，在植物逆境脅迫下起著關(guān)鍵作用［29］。研究發(fā)現(xiàn)，在病原菌脅迫條件下，脯氨酸含量會升高。當(dāng)施加木霉后，木霉調(diào)控脯氨酸的方式有2種。第1種是木霉先增加脯氨酸的含量，通過脯氨酸來調(diào)節(jié)細(xì)胞的內(nèi)滲透，降低細(xì)胞的損傷［30］；第2種是木霉可以直接降低病原菌對植物的脅迫，從而使脯氨酸含量降低［31］。如王欣玉等的研究表明，在擬南芥中，單獨(dú)用病原菌處理的脯氨酸含量高于木霉和病原菌共同處理的脯氨酸含量［31］，本研究結(jié)果與之一致，推測哈茨木霉T-aloe可能是通過第2種方式來調(diào)控小麥幼苗內(nèi)的脯氨酸含量。一些抗氧化防御酶也可以清除植物體內(nèi)的O-2·和H2O2，維持氧化自由基的平衡，減輕植物的病害程度，比如過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）［32］。POD和CAT可以清除植物體內(nèi)過量的H2O2，將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2，避免細(xì)胞受到侵害［33］。本研究表明，在病原菌PH-1的脅迫下，小麥細(xì)胞膜的受損傷程度增強(qiáng)，幼苗內(nèi)的MDA含量以及脯氨酸含量升高，隨著病原菌脅迫時間的延長，POD和CAT活性下降，推測可能是防御酶系統(tǒng)遭到破壞。而先用木霉處理過的小麥，其MDA含量以及脯氨酸含量降低，POD和CAT活性升高（圖3），說明哈茨木霉T-aloe可以降低小麥細(xì)胞的膜脂過氧化，提高小麥的防御酶活性，清除過量的ROS，阻止病原菌侵害小麥幼苗，從而提高小麥的抗病能力。在本研究中，病原菌PH-1侵染的第10、20天，大田防治效果分別為68.42%、32.65%，均高于陽性對照。說明哈茨木霉T-aloe對田間小麥赤霉病的防治有明顯的作用（圖4和表3）。

哈茨木霉T-aloe作為一株既促生又抗病的優(yōu)勢菌株，具有開發(fā)成商業(yè)生物菌劑的巨大潛力。為了降低生物菌劑的生產(chǎn)和運(yùn)輸成本，研究T-aloe的液體發(fā)酵產(chǎn)孢條件是很有必要的。在實(shí)際應(yīng)用中，木霉的孢子必須達(dá)到一定的數(shù)量，才會在競爭中發(fā)揮優(yōu)勢［34］。本研究分析了培養(yǎng)基、溫度、接種量和轉(zhuǎn)速4個因素對T-aloe產(chǎn)孢的影響。液體發(fā)酵時，糖蜜、酵母膏以及其他農(nóng)用廢棄原料常作為木霉發(fā)酵的原料。Lewis等發(fā)現(xiàn)，用發(fā)酵罐發(fā)酵木霉時，以糖蜜和酵母粉為培養(yǎng)基可以提高產(chǎn)孢量［35］。本研究發(fā)現(xiàn)，T-aloe產(chǎn)孢量最大的培養(yǎng)基是糖蜜-酵母膏培養(yǎng)基，與Lewis的研究結(jié)果［35］一致。溫度也是木霉生長繁殖的重要因素之一，木霉生長的最適溫度是20～28 ℃。溫度過高會破壞木霉胞內(nèi)的酶活性，抑制木霉生長，還會使木霉中的蛋白質(zhì)降解或變性，嚴(yán)重時導(dǎo)致木霉死亡，而溫度過低也會抑制木霉的生長［36］。由于木霉屬菌株種類較多，不同種生長的最適溫度也不盡相同。尤佳琪等發(fā)現(xiàn)，擬康寧木霉T-51在PDA培養(yǎng)基上的最大產(chǎn)孢溫度是20 ℃，而本研究中T-aloe的最大產(chǎn)孢溫度是31 ℃。接種量也是木霉發(fā)酵過程中的重要參數(shù)［37］，若接種量過大，培養(yǎng)基的消耗加快，造成木霉菌的營養(yǎng)缺乏，菌體快速進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期，不利于發(fā)酵產(chǎn)物的生成；若接種量過低，則會延長菌體到達(dá)對數(shù)生長期的時間，延長發(fā)酵周期，不利于酶產(chǎn)物的生成［38］。洪亮等從枇杷中分離出1株內(nèi)生木霉P3.9，它在液體發(fā)酵過程中的最適接種量是1.5%，而本研究中T-aloe的最適接種量為5%。溶解氧是優(yōu)化次級代謝產(chǎn)物的重要參數(shù)，在產(chǎn)孢過程中起著關(guān)鍵作用［39-40］。Felse等發(fā)現(xiàn)，通過攪拌增加的溶氧量可以影響木霉的生長，并推斷極端攪拌條件不利于木霉菌的產(chǎn)孢［41］。T-aloe發(fā)酵產(chǎn)孢的最適轉(zhuǎn)速是180 r/min。目前，木霉的液體發(fā)酵常用于發(fā)酵各種酶及其次級代謝產(chǎn)物，對液體產(chǎn)孢條件優(yōu)化的報道甚少，本研究將為木霉液體發(fā)酵產(chǎn)孢提供有用的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)：

［1］朱展望. 利用全基因組連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析定位小麥赤霉病抗性基因及分子標(biāo)記開發(fā)［D］. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2020：1-2.

［2］Dweba C C，F(xiàn)iglan S，Shimelis H A，et al. Fusarium head blight of wheat：pathogenesis and control strategies［J］. Crop Protection，2017，91（2017）：114-122.

［3］蘇培森. 小麥赤霉病抗病機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)進(jìn)展，2021，11（5）：599-609.

［4］張承啟. 新型殺菌劑氰烯菌酯對禾谷鐮刀菌的作用機(jī)制研究［D］. 杭州：浙江大學(xué)，2016：3-4.

［5］李夢婷. 小麥赤霉病菌對丙硫菌唑的抗藥性評價［D］. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2021：14-15.

［6］Sood M，Kapoor D，Kumar V，et al. Trichoderma：the “secrets” of a multitalented biocontrol agent［J］. Plants，2020，9（6）：762-786.

［7］Sharon E，Chet I，Spiegel Y. Biological control of plant-parasitic nematodes：building coherence between microbial ecology and molecular mechanisms［M］. Heidelberg：Springer Science & Business Media，2011，183-201.

［8］Saba H，Vibhash D，Manisha M，et al. Trichoderma—a promising plant growth stimulator and biocontrol agent［J］. Mycosphere，2012，3（4）：524-531.

［9］孫 虎，楊麗榮，全 鑫，等. 木霉生防機(jī)制及應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報，2011，27（3）：242-246.

［10］Zehra A，Dubey M K，Meena M，et al. Effect of different environmental conditions on growth and sporulation of some Trichoderma species［J］. Journal of Environmental Biology，2017，38（2）：197-203.

［11］Shahid M，Singh A，Srivastava M，et al. Effect of temperature，pH and media for growth and sporulation of Trichoderma longibrachiatum and self life study in carrier based formulations［J］. Annals of Plant Protection Science，2011，19（1）：147-149.

［12］隋永輝. 綠色木霉孢子的高密度發(fā)酵及其對植物生長的調(diào)控研究［D］. 濟(jì)南：齊魯工業(yè)大學(xué)，2021：9-10.

［13］池玉杰，伊洪偉，吉海龍. 長枝木霉菌株T05液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)孢和菌絲生物量條件的篩選［J］. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2016，44（1）：110-113.

［14］陳建愛，賈夢瑩，陳為京. PDA中水含量對固體培養(yǎng)黃綠木霉T1010分生孢子生長發(fā)育的影響［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報，2020，36（15）：106-114.

［15］魏洪璇，陳向東，汪 輝，等. 哈茨木霉的分離純化、鑒定及發(fā)酵液活性的初步研究［J］. 藥物生物技術(shù)，2017，24（3）：206-210.

［16］粟 靜，羅志威，呂 黎，等. 哈茨木霉液體發(fā)酵產(chǎn)厚垣孢子條件的優(yōu)化［J］. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（2）：169-173．

［17］劉 梅，喬 敏，徐 同，等. 哈茨木霉液體發(fā)酵工藝研究［J］. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，15（3）：279-281．

［18］何啟平，陳 瑩. 校園常見植物葉綠素提取方法比較及其含量測定［J］. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，2015（10）：117-120．

［19］劉 萍，李明軍. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］. 北京：科學(xué)出版，2007：144-146.

［20］王路遙. 小麥禾谷鐮孢病害的生物防治及其機(jī)理研究［D］. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018：69-70.

［21］Chen J L，Sun S Z，Miao C P，et al. Endophytic Trichoderma gamsii YIM PH30019：a promising biocontrol agent with hyperosmolar，mycoparasitism，and antagonistic activities of induced volatile organic compounds on root-rot pathogenic fungi of Panax notoginseng［J］. Journal of Ginseng Research，2016，40（4）：315-324.

［22］徐 文. 木霉-黃瓜互作過程中抗病信號傳遞途徑分析［D］. 天津：河北工業(yè)大學(xué)，2017：2-3.

［23］Stewart A，Hill R. Biotechnology and biology of Trichoderma［M］. Amsterdam：Elsevier，2014：415-428.

［24］Joshi B B，Bhatt R P，Bahukhandi D. Antagonistic and plant growth activity of Trichoderma isolates of Western Himalayas［J］. Journal of Environmental Biology，2010，31（6）：921-928.

［25］Goswami R S，Kistler H C. Heading for disaster：Fusarium graminearum on cereal crops［J］. Molecular Plant Pathology，2004，5（6）：515-525.

［26］廉 華，陳玉蓉，李 梅，等. 木霉分生孢子和厚垣孢子對黃瓜幼苗生理特性及枯萎病防效的影響［J］. 干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2021，39（2）：227-235.

［27］王光濤，馮素偉，丁位華，等. 根際pH值對冬小麥葉片抗氧化酶活性和內(nèi)源激素含量的影響［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，49（10）：71-75.

［28］謝琳淼. 哈茨木霉對鎘脅迫下兩種草坪草生長及生理特性的影響［D］. 哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2018：2-3.

［29］張 凈，王錦霞，郭萌萌，等.甜菜幼苗對干旱脅迫的適應(yīng)機(jī)制［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報，2020，36（32）：1-7.

［30］馬光恕，張 渟，李潤哲，等.擬康氏木霉菌劑對黃瓜幼苗生長、抗氧化系統(tǒng)及枯萎病防效的影響［J］. 干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2022，40（6）：72-81，107.[HJ2mm]

［31］王欣玉. 生防木霉對擬南芥的抗病及促生機(jī)理研究［D］. 哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2018：29-33.

［32］Cheng C，Zhang Y，Zhong Y，et al. Gene expression changes in leaves of Citrus sinensis （L.） Osbeck infected by Citrus tristeza virus［J］. The Journal of Horticultural Science and Biotechnology，2016，91（5）：466-475.

［33］吳雨涵，劉文輝，劉凱強(qiáng)，等. 干旱脅迫對燕麥幼苗葉片光合特性及活性氧清除系統(tǒng)的影響［J］. 草業(yè)學(xué)報，2022，31（10）：75-86.

［34］Zhang J D，Yang Q. Optimization of solid-state fermentation conditions for Trichoderma harzianum using an orthogonal test［J］. Genetics Molecular Research，2015，14（1）：1771-1781.

［35］Lewis J A，Papavizas G C. Production of chlamydospores and conidia by Trichoderma spp. in liquid and solid growth media［J］. Soil Biology and Biochemistry，1983，15（3）：351-357.

［36］蒲丹丹，李 艷，趙麗紅，等. 簡青霉CEF-818固體發(fā)酵工藝優(yōu)化［J］. 中國生物防治學(xué)報，2022，38（3）：636-644.

［37］尤佳琪，杜 然，顧衛(wèi)紅，等. 擬康寧木霉T-51菌株生物學(xué)特性及其生物防治潛力［J］. 植物保護(hù)學(xué)報，2022，49（3）：946-955.

［38］張文芝，郭堅(jiān)華. 微生物發(fā)酵工藝優(yōu)化研究進(jìn)展［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，40（6）：114-117.

［39］洪 亮，胡金碧，魯海菊，等. 枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株液體發(fā)酵條件優(yōu)化篩選［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，56（14）：2670-2674.

［40］Verma M，Brar S K，Tyagi R D，et al. Antagonistic fungi，Trichoderma spp.：panoply of biological control［J］. Biochemical Engineering Journal，2007，37（1）：1-20.

［41］Felse P A，Panda T. Submerged culture production of chitinase by Trichoderma harzianum in stirred tank bioreactors-the influence of agitator speed［J］. Biochemical Engineering Journal，2000，4（2）：115-120.