楊琴，劉明容，蒲雪，王芯

（樂山市中醫(yī)醫(yī)院，四川 樂山 614000）

道地藥材是具有中國(guó)特色、根植于中醫(yī)藥理論體系、來源于生產(chǎn)和用藥實(shí)踐、世人所公認(rèn)的特定產(chǎn)區(qū)名優(yōu)正品藥材的代名詞。川牛膝作為著名川產(chǎn)道地藥材之一，藥用歷史悠久[1]。川牛膝為莧科植物川牛膝（Cyathula officinalis Kuan）的干燥根，現(xiàn)收載于2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）；其味甘、微苦，性平，歸肝、腎經(jīng)，具有逐瘀通經(jīng)、通利關(guān)節(jié)、利尿通淋之功[2]。滕利等[3]從川牛膝分離純化了15個(gè)化合物。馬篤軍等[4]以兔骨關(guān)節(jié)炎模型從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度驗(yàn)證了川牛膝功效成分。然而隨著時(shí)代變遷，川牛膝也存在著品種混亂、應(yīng)用不當(dāng)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)低等現(xiàn)狀[5]。

由于農(nóng)藥使用不當(dāng)和生產(chǎn)環(huán)境污染等因素，中藥材中農(nóng)藥殘留已經(jīng)成為一個(gè)不容忽視的問題[6]。王瑩等[7]建立了符合中藥使用特點(diǎn)的農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系，形成了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的指導(dǎo)原則，用以開展中藥中農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作。高巖等[8]對(duì)全國(guó)中藥資源普查女貞子樣品中農(nóng)藥殘留進(jìn)行分析，檢測(cè)出5種農(nóng)藥殘留。農(nóng)藥殘留進(jìn)入人體蓄積后會(huì)導(dǎo)致多種疾病，如引發(fā)心肌炎[9]、危害神經(jīng)系統(tǒng)、損傷內(nèi)臟[10]。此外，為了推動(dòng)中藥材的國(guó)際化，將中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)推向世界，中藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)水平需要不斷提高[11]。

檢測(cè)中藥材農(nóng)藥殘留的方法較多，如張慧等[12]建立了液質(zhì)聯(lián)用法分析牛膝飲片中農(nóng)藥殘留。此外，目前還有氣相色譜法、液相色譜法、毛細(xì)管電泳法[13]、氣質(zhì)聯(lián)用法[14]、拉曼光譜法[15]等方法。電化學(xué)法[16]和酶聯(lián)免疫法應(yīng)用范圍較少，同時(shí)存在假陽性和假陰性的缺點(diǎn)，還在進(jìn)一步完善中；色譜類儀器因?yàn)閮r(jià)格較低、普及比較廣泛，但定性能力較差；氣質(zhì)聯(lián)用法和液質(zhì)聯(lián)用法被國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和藥典采用的越來越多，有高通量[17]、定性能力強(qiáng)[18]、靈敏度高等諸多優(yōu)點(diǎn)[19]。本研究選取大多為中高毒性和使用率較高的農(nóng)藥作為考察對(duì)象，建立QuECh－ERS結(jié)合在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GPCGC-MS/MS）測(cè)定川牛膝中24種農(nóng)藥殘留的方法，旨在為中藥材的生產(chǎn)與質(zhì)量控制提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 在線GPC-GC-MS/MS系統(tǒng)（島津中國(guó)有限公司，型號(hào)：TQ-8040）；垂直振蕩器[?？萍瘓F(tuán)（廈門）股份有限公司，型號(hào)：V12]；高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，型號(hào)：CHT210R）；電子天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)，型號(hào)：BSA224S）；氮吹儀（廣州得泰儀器科技有限公司，型號(hào)：MFV-12）；刀式研磨儀（北京格瑞德曼儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：HM300）。

1.2 材料 敵敵畏（100 μg/mL，1 mL，批號(hào)：GSB05-2298-2016，有效期：2022年12月20日）、滅線磷（100 μg/mL，1 mL，批號(hào)：GSB05-1877-2016，有效期：2022年12月20日）、甲拌磷（100 μg/mL，1 mL，批號(hào)：GSB05-2294-2016，有效期：2022年12月20日）、樂果（100 μg/mL，1 mL，批號(hào)：GSB05-2286-2016，有效期：2023年6月27日）、氯唑磷（100 μg/mL，1 mL，批號(hào)：SB05-116-2008，有效期：2022年12月20日）、馬拉硫磷（100 μg/mL，1 mL，批號(hào)：GSB05-2293-2016，有效期：2022年12月20日）、毒死蜱（100 μg/mL，1 mL，批號(hào)：GSB05-1869-2016，有效期：2022年12月20日）、水胺硫磷（100 μg/mL，1 mL，批號(hào)：GSB05-2332-2016，有效期：2022年12月20日）、甲基異柳磷（100 μg/mL，1 mL，批號(hào)：GSB05-2335-2016，有效期：2022年12月20日）、氟蟲腈（100μg/mL，1 mL，批號(hào)：SB05-071-2008，有效期：2022年12月20日）、腐霉利（100 μg/mL，1 mL，批號(hào)：GSB05-2338-2016，有效期：2022年12月20日）、殺撲磷（100 μg/mL，1 mL，批號(hào)：GSB05-2295-2016，有效期：2022年12月20日）、丙溴磷（100 μg/mL，1 mL，批號(hào)：GSB05-2640-2010，有效期：2022 年12 月20 日）、三唑 磷（100 μg/mL，1 mL，批號(hào)：GSB05-2650-2010，有效期：2022年12月20日）、戊唑醇（100 μg/mL，1 mL，批號(hào)：GSB05-2643-2010，有效期：2022年12月20日）、氟環(huán)唑（100 μg/mL，1 mL，批號(hào)：SB05-336-2016，有效期：2023年6月26日）、聯(lián)苯菊酯（100μg/mL，1 mL，批號(hào)：GSB05-2333-2016，有效期：2022年12月20日）、甲氰菊酯（100 μg/mL，1 mL，批號(hào)：GSB05-2306-2016，有效期：2022年12月20日）、氯氟氰菊酯（100 μg/mL，1 mL，批號(hào)：SB05-422-2018，有效期：2023年4月22日）、噠螨靈（100 μg/mL，1 mL，批號(hào)：GSB05-2658-2010，有效期：2023年6月26日）、腈苯唑（100 μg/mL，1 mL，批號(hào)：SB05-150-2008，有效期：2023年6月26日）、氯氰菊酯（100 μg/mL，1 mL，批號(hào)：GSB05-2308-2016，有效期：2022年12月20日）、氰戊菊酯（100 μg/mL，1 mL，批號(hào)：GSB05-2307-2016，有效期：2022年12月20日）、溴氰菊酯（100 μg/mL，1 mL，批號(hào)：GSB05-2310-2016，有效期：2022年12月20日）均購(gòu)自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。環(huán)氧七氯B對(duì)照品（100 μg/mL，1 mL，批號(hào)：G21120231，有效期：2023年3月1日）購(gòu)自北京壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

乙腈、丙酮、環(huán)己烷均為色譜純，購(gòu)自百靈威科技有限公司。無水硫酸鎂、無水乙酸鈉均為優(yōu)級(jí)純，購(gòu)自成都科龍化工試劑廠。N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠、硅膠、石墨化炭黑（GCB）均購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

川牛膝樣品均購(gòu)于樂山市各區(qū)縣藥店及中藥材公司。經(jīng)李佳霖副主任中藥師鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 氣相色質(zhì)譜條件（1）進(jìn)樣口：280 ℃，不分流（PTV進(jìn)樣）。（2）毛細(xì)管柱：Rtx-5silMS（30 m×0.25 mm，0.25 μm），柱溫采用梯度升溫，起始溫度40 ℃（保持1 min），以25 ℃/min升至130 ℃，以10 ℃/min升至270 ℃（保持15 min）。（3）線速度：70 cm/s。（4）載氣：高純氦氣，純度大于99.999%。（5）溶劑延遲：9.5 min；離子源為EI源，溫度220 ℃；MS接口溫度為260℃。（6）PTV進(jìn)樣口溫度程序：初始溫度120 ℃，保持5 min，然后以100 ℃/min升溫至250 ℃，保持27.5 min。（7）進(jìn)樣口壓力程序：初始?jí)毫?20 kPa，以100 kPa/min升壓至180 kPa，保持4.4 min，然后以49.8 kPa/min降壓至120 kPa，保持27.6min。（8）隔墊吹掃程序：初始流量5.0 mL/min，進(jìn)樣采集后以10 mL/min的速度降低至0mL/min，保持6min，然后以10mL/min的速度升至5mL/min，保持5 min。（9）GPC條件。色譜柱：Shodex CLNpak EV-200（2.1 mm×150 mm，16 μm）；流動(dòng)相：丙酮-環(huán)己烷[V（丙酮）∶V（環(huán)己烷）=3∶7]；流速：0.1 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。在線式凝膠色譜時(shí)間控制程序見表1。

表1 在線式凝膠色譜時(shí)間控制程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 取24種對(duì)照品各1支，準(zhǔn)確移取1 mL，用丙酮-環(huán)己烷[V（丙酮）∶V（環(huán)己烷=3∶7）]稀釋定容至10 mL混勻，配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，冷藏備用。按照樣品制備處理方法，提取空白基質(zhì)溶液，用于不同濃度對(duì)照品系列工作溶液的配制。

2.2.2 供試品溶液的制備 取供試品，用研磨機(jī)制成細(xì)粉，精密稱取3 g于50 mL帶蓋離心管中，加入1%冰醋酸溶液15 mL，渦旋使藥粉充分浸潤(rùn)，放置30 min，精密加入乙腈15 mL，渦旋使混勻，置振蕩器上劇烈振蕩5 min，-20 ℃下冷凍10 min。加入無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合粉末（質(zhì)量比為4∶1）7.5 g，立即搖散，在振蕩器上劇烈振蕩3 min，于-20 ℃下冷卻5 min，離心（6 000 r/min）5 min，移取7 mL上層溶液，置于已預(yù)先裝有凈化材料的離心管中 [無水硫酸鎂900 mg，N-丙基乙二胺（PSA）300 mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg，硅膠300 mg，石墨化炭黑（GCB）90 mg]，渦旋使充分混勻，再置于振蕩器上劇烈振蕩（500次/min）5 min使凈化完全，離心（6 000 r/min）5 min，精密吸取上清液5 mL，置于氮吹儀上用40 ℃水浴濃縮至約0.2 mL，加乙腈定容至1 mL，再加入20 μL環(huán)氧七氯B作為內(nèi)標(biāo)，渦旋混勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，濾液上機(jī)測(cè)定。

2.3 前處理及質(zhì)譜條件的優(yōu)化 農(nóng)藥殘留的檢測(cè)經(jīng)常采用正己烷、丙酮、乙腈、乙酸乙酯作為提取溶劑，但丙酮有機(jī)相與水相不易分開，乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，同時(shí)丙酮目前為管制試劑，故不予以考慮。在同樣的條件下，本試驗(yàn)采用正己烷、乙腈、乙酸乙酯對(duì)目標(biāo)成分進(jìn)行提取。結(jié)果表明：正己烷對(duì)有機(jī)氯菊酯類農(nóng)藥有較好的回收率；乙酸乙酯對(duì)各農(nóng)藥殘留提取率一般，回收率不穩(wěn)定；乙腈對(duì)各成分均有較好的回收率，得到的溶液顏色也最淺。本研究綜合考慮將乙腈作為提取試劑。加入冰醋酸水溶液一方面可以將供試品充分浸潤(rùn)，有利于乙腈的滲透，另一方面酸性條件下也使得農(nóng)藥更為穩(wěn)定可防止其降解。各種填料凈化劑GCB、C18和PSA的使用，可以有效吸附非極性雜質(zhì)、色素、糖、脂肪等，減少基質(zhì)效應(yīng)和對(duì)氣質(zhì)聯(lián)用儀的污染，提高檢測(cè)的靈敏度。在建立氣質(zhì)聯(lián)用方法時(shí)本研究選擇農(nóng)藥殘留離子碎片中質(zhì)荷比大，響應(yīng)高的離子進(jìn)行二次碎裂，得到定性定量離子對(duì)。24種農(nóng)殘保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)見表2。以環(huán)氧七氯B作為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)一步校正各種誤差對(duì)測(cè)定結(jié)果帶來的影響，可保證結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。

表2 農(nóng)藥殘留保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)

2.4 在線式凝膠色譜與QuEChERS方法的比較 經(jīng)QuEChERS方法提取凈化后的溶液顏色深淺不一，說明仍然有干擾物存在于溶液中，也直接導(dǎo)致了較為明顯的基質(zhì)效應(yīng)。在線式凝膠滲透色譜的原理主要根據(jù)不同化合物分子量的大小進(jìn)行分離，通過儀器的時(shí)間程序控制可以精確的將農(nóng)藥殘留目標(biāo)成分與提取液中的油脂、色素、糖類等大分子物質(zhì)分離。質(zhì)譜掃描圖顯示，經(jīng)過在線凝膠滲透色譜再次凈化后，相比單一的QuEChERS方法，色譜圖基線更加平滑，雜峰明顯減少，降低了分析背景，靈敏度進(jìn)一步得到了提高。（見圖1～2）

圖1 提取液經(jīng)QuEChERS 凈化后總離子流色譜圖

圖2 提取液經(jīng)QuEChERS 和在線凝膠滲透色譜凈化后總離子流色譜圖

2.5 基質(zhì)效應(yīng)考察 本試驗(yàn)分別以純?nèi)軇┖涂瞻谆|(zhì)溶液配制對(duì)照品系列工作溶液，在不經(jīng)在線式凝膠滲透色譜（GPC）凈化條件下進(jìn)行GC-MS/MS進(jìn)樣分析，擬合線性回歸方程后，通過比較兩者斜率來評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)的影響。計(jì)算公式為ME=A/B×100%，其中A為目標(biāo)成分用基質(zhì)溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，B為目標(biāo)成分用純?nèi)軇┡渲频臉?biāo)準(zhǔn)曲線斜率，ME＞100%表示有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，ME＜100%表示有基質(zhì)減弱效應(yīng)。分別配制低、中、高3個(gè)濃度的對(duì)照品溶液，測(cè)定并計(jì)算后結(jié)果見表3。低濃度下有15種農(nóng)藥殘留存在非常明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)：隨著基質(zhì)濃度的升高，基質(zhì)效應(yīng)有減弱的趨勢(shì)，但是仍有少數(shù)農(nóng)藥呈現(xiàn)增強(qiáng)的結(jié)果。為了減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，本試驗(yàn)采用空白基質(zhì)溶液配制對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測(cè)。

表3 農(nóng)藥殘留基質(zhì)效應(yīng)測(cè)定結(jié)果

2.6 線性范圍與檢測(cè)限、定量限考察 將24種農(nóng)藥殘留對(duì)照品溶液用空白基質(zhì)提取液稀釋成0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μg/mL的對(duì)照品系列工作溶液，加入20 μL環(huán)氧七氯B內(nèi)標(biāo)溶液，過微孔濾膜配制成系列基質(zhì)混合對(duì)照品工作溶液，供測(cè)定用。以農(nóng)藥殘留定量離子峰面積和內(nèi)標(biāo)物定量離子峰面積的比值為縱坐標(biāo)、農(nóng)藥對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度的比值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍的S/N計(jì)算方法為檢測(cè)限，以10倍的S/N計(jì)算方法為定量限，結(jié)果見表4。在0～0.5 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，24種農(nóng)藥殘留檢測(cè)限范圍為0.001～0.008 mg/kg，定量限為0.003～0.020 mg/kg。

表4 24 種農(nóng)藥殘留線性范圍和檢測(cè)限、定量限

2.7 準(zhǔn)確度與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差考察 為驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，本試驗(yàn)向空白基質(zhì)樣品中添加低、中、高濃度的農(nóng)藥殘留對(duì)照品溶液，依照上述樣品提取方法制備提取液，上機(jī)測(cè)試，同時(shí)平行測(cè)定3次，結(jié)果見表5。加標(biāo)樣品總離子流色譜圖見圖3。各農(nóng)藥殘留加標(biāo)回收率為68.4%～111.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%～8.8%。樂果、氟環(huán)唑在低濃度水平下回收率稍低，可能的原因?yàn)樗〉禃r(shí)有損失。同時(shí)各種填料凈化劑GCB、C18和PSA的使用，除了凈化樣品基質(zhì)外，對(duì)目標(biāo)成分也會(huì)有不同程度的吸附作用，從而造成回收率降低。

表5 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）

圖3 加標(biāo)樣品總離子流色譜圖

2.8 對(duì)照品溶液及儀器穩(wěn)定性考察 將空白基質(zhì)配制的對(duì)照品溶液分別于0、12、24 h后進(jìn)樣分析，考察對(duì)照品溶液及儀器的穩(wěn)定性。圖4顯示，各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照品溶液峰面積均無明顯差異，說明穩(wěn)定性良好。

圖4 對(duì)照品溶液及儀器穩(wěn)定性

2.9 川牛膝質(zhì)量分析 通過對(duì)37批次購(gòu)買的川牛膝樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，有3批次川牛膝含有高于定量限的農(nóng)藥殘留，包括毒死蜱、丙溴磷、聯(lián)苯菊酯、氯氰菊酯、氯氟氰菊酯。原因可能是種植戶未嚴(yán)格按照農(nóng)藥使用規(guī)范施用，也有可能受到相鄰種植區(qū)間水果蔬菜噴灑農(nóng)藥的污染。此外，川牛膝在低海拔與糧食作物的間種也會(huì)導(dǎo)致農(nóng)藥殘留的檢出。

3 討 論

道地藥材是優(yōu)質(zhì)中藥材代名詞，傳承、發(fā)展、推廣好道地藥材離不開科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和有效的檢測(cè)手段[20]。目前尚未有川牛膝農(nóng)藥殘留的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，故本研究建立了QuECh－ERS結(jié)合在線GPC-GC-MS/MS法測(cè)定川牛膝中24種農(nóng)藥殘留的方法。

乙腈提取、QuEChERS凈化、利用在線凝膠滲透色譜都是為了減少基質(zhì)效應(yīng)的干擾[21]，提高目標(biāo)物的富集程度和靈敏度[22]。本研究在對(duì)比了空白基質(zhì)配制對(duì)照品與純?nèi)軇┡渲茖?duì)照品測(cè)定結(jié)果的影響后，發(fā)現(xiàn)川牛膝農(nóng)藥殘留測(cè)定過程中存在比較嚴(yán)重的基質(zhì)干擾，而空白基質(zhì)配制對(duì)照品和應(yīng)用在線凝膠滲透色譜可以在很大程度上減小這種效應(yīng)，并且能有效避免對(duì)氣質(zhì)聯(lián)用儀的污染。內(nèi)標(biāo)法定量能夠充分降低各種誤差對(duì)測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，同時(shí)多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)進(jìn)行定量可以最大程度上避免測(cè)試時(shí)假陽性和假陰性的產(chǎn)生[23]。由于平衡凈化效果和時(shí)間成本的考慮，個(gè)別農(nóng)藥殘留回收率稍低，但整體上線性關(guān)系、靈敏度、準(zhǔn)確度和方法的穩(wěn)定性都滿足了測(cè)定的需要，同時(shí)該方法還具有高通量、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。隨著檢測(cè)技術(shù)和監(jiān)測(cè)水平的提高，越來越多的標(biāo)準(zhǔn)將采用質(zhì)譜法作為主要的農(nóng)藥殘留分析手段，從而促進(jìn)中藥材生產(chǎn)種植標(biāo)準(zhǔn)化的提升。