李汶珊，易曉利，卜獻春，袁春云，劉佳琴，吳剛強，毛葉，陳琪，譚軍

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.長沙衛(wèi)生職業(yè)學院，湖南 長沙 410100；3.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410006）

糖尿病患病率逐年上升，目前已經成為影響人類身體健康的第三大慢性非傳染性疾病[1]。糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病最嚴重的并發(fā)癥之一，是糖尿病引起死亡的主要原因[2]。心肌纖維化是DCM的主要病理改變，長期糖脂代謝紊亂導致蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）激活及引起氧化應激損傷是導致心肌纖維化的主要因素[3]。因此，積極糾正糖脂代謝紊亂引起的一系列病理反應是抗心肌纖維化的關鍵[4]，對治療及延緩DCM發(fā)生及發(fā)展具有重大臨床意義。

中醫(yī)學認為DCM病因病機主要以氣陰兩虛為本，瘀阻血脈為標，益氣養(yǎng)陰、活血通絡為其主要治法。多項研究顯示，益氣養(yǎng)陰活血化瘀法治療DCM療效顯著[5-6]。滋膵通脈飲是治療氣陰兩虛、瘀血阻絡型糖尿病及并發(fā)癥的有效方藥，前期臨床觀察顯示，滋膵通脈飲能有效改善DCM患者臨床癥狀，但其具體機制不明確[7-9]。本研究擬建立DCM大鼠模型，從糖脂代謝紊亂、氧化應激損傷及PKC-β激活探討滋膵通脈飲治療DCM作用機制，為進一步臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6周齡SPF級雄性SD大鼠51只，體質量180～200 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2019-0004，常規(guī)條件飼養(yǎng)，室溫為20～23 ℃，濕度為50%～65%，自然采光。本實驗通過湖南省中醫(yī)藥研究院動物實驗倫理審查，倫理編號：2021-0018。

1.2 藥物與試劑 滋膵通脈飲，方藥組成：黃芪10 g，地龍10 g，生蒲黃15 g，生地黃15 g，水蛭6 g，僵蠶10 g，麥冬10 g，丹參20 g，川芎10 g，玄參10 g，山茱萸10 g，天花粉10 g，鬼箭羽15 g，全蝎3 g，山楂15 g。以上中藥顆粒均購自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院康仁堂藥房，由楊華主管中藥師鑒定合格。通過水溶解法進行滋膵通脈飲藥液的提取制備。PKC-βⅡ抑制劑[Ruboxistaurin（LY333531）HCl]（目錄號：S7663，批次：01）、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）（目錄號：S6703，批次：04）均購自上海藍木化工有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（批號：301A0214）、0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（批號：20210429）均購自北京索萊寶科技有限公司；空腹胰島素（FINS）ELISA試劑盒（批號：21AUURI801A）購自CRYSTAL CHEM INC；糖化血紅蛋白（GHb）試劑盒（批號：20210701）、甘油三酯（TG）試劑盒（批號：20210625）、總膽固醇（T-CHO）試劑盒（批號：20210625）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒（批號：20210625）、微量丙二醛（MDA）試劑盒（批號：20210622）均購自南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號：TM703）購自東仁化學科技上海有限公司；PKC-βⅡ一抗（批號：GR204604-2）購自英國abcam公司；5%多聚甲醛（批號：WB03004）、戊二醛溶液（2.5%）（批號：WB01026A2）均購自Wellbioscience公司；水合三氯乙醛（批號：F2103035）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 主要儀器 JJ224BC型電子天平（美國雙杰）；EZ-7 Lite型血糖儀、H1型血糖試條（北京華益精點生物技術有限公司）；注式soft型一次性使用采血針（施萊醫(yī)療）；H1650R型臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；TS-1型搖床、GL-88B型旋渦混合器（江蘇其林貝爾儀器公司）；DYY-6C型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽、DYCZ-40D型轉膜儀、DYY-6C型恒溫箱（北京六一生物科技有限公司）；JB-13型磁力攪拌器、PHS-3C型精密pH計（雷磁上海儀電科學儀器股份有限公司）；BCD-196A型普通冰箱（奧克斯集團有限公司）；HD4925型電磁爐（荷蘭飛利浦）；BioPrep-24型生物樣品均質儀（杭州奧盛儀器有限公司）；MM721AAU-PW型微波爐（美的集團有限公司）；M199型切片刀（德國萊卡公司）；YD-315型切片機（金華益迪醫(yī)療設備有限公司）；BMJ-A型包埋機（常州中威電子儀器有限公司）；BA210T型顯微鏡（麥克奧迪）；DY89-1型蓋玻片、AY89-2型載玻片（海門市遠泰實驗器材廠）。

1.4 造模與分組 51只大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法抽取9只作為空白對照組，采用普通飼料喂養(yǎng)；剩余42只大鼠造模。采用高糖高脂飼料（豬油10%+膽固醇2%+膽酸鹽0.5%+蔗糖20%+普通飼料67.5%）飲食，連續(xù)喂養(yǎng)5周。42只大鼠隔夜禁食不禁水12 h以上，1%的STZ溶液（將STZ置于pH=4.3的檸檬酸緩沖液中），以35 mg/kg單次腹腔注射，建立2型糖尿病模型?？瞻讓φ战M大鼠腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液。注射STZ后第1天及第3天2次隨機血糖均≥16.7 mmol/L即提示造模成功[10]。造模過程中有3只大鼠死亡，主要死亡原因為感染。造模成功39只，造模成功率為92.9%（39/42），再用高脂飼料喂養(yǎng)2周，以強化胰島素抵抗模型[11]。為保證各組樣本量一致性，從造模成功的大鼠中采用隨機數(shù)字表法抽取36只分為模型組、Rx抑制劑組、滋膵通脈飲高劑量組、滋膵通脈飲低劑量組，每組9只；剩余未入組3只大鼠采用按0.5 mL/100 g劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉處死。

1.5 實驗給藥 滋膵通脈飲含生藥量169 g，參照70 kg成人和200 g大鼠體表面積比值為0.018換算，滋膵通脈飲高、低劑量組灌胃給予滋膵通脈飲藥液，給藥劑量分別為60.84、15.21 g/kg（相當于臨床成人用量的9.64、2.41 g/kg），高劑量為低劑量的4倍；Rx抑制劑組大鼠灌胃給予Rx抑制劑混懸液（將Rx抑制劑用0.5%CMC-Na溶液配制成混懸液），給藥劑量為1 mg/kg，模型組和空白對照組大鼠灌胃給予等體積的蒸餾水，5組大鼠灌胃容量均為10 mL/kg，2次/d（08:00:00和17:00:00各給藥1次），連續(xù)給藥4周。

1.6 觀察指標

1.6.1 一般情況觀察 分別于治療前后（造模成功后和治療4周后）在自然光下觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、活動度、皮毛顏色、亮度、柔順度、飲食量及尿量等。

1.6.2 體質量 分別于治療前后用天平測各組大鼠體質量，抓取手法嚴格按照《實驗動物的抓取與固定操作規(guī)程》進行，讀取穩(wěn)定數(shù)值，若數(shù)值難以穩(wěn)定，讀取中間數(shù)值。

1.6.3 空腹血糖（fiber bragg grating，F(xiàn)BG）分別于治療前后采用葡萄糖氧化酶法測定各組大鼠FBG水平。

1.6.4 空腹胰島素（fasting serum lisulin，F(xiàn)INS）、胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）和糖化血紅蛋白（hemoglobin A1C，HbA1C）治療4周后，分別采用各試劑盒檢測各組大鼠FINS水平及HbA1C水平，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，并通過FBG及FINS計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），HOMA-IR=[(FBG×FINS)/22.5]。

1.6.5 甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，T-CHO）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）治療4周后，分別采用各試劑盒檢測各組大鼠TG、T-CHO及LDL-C水平，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6.6 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及丙二醛酸（malondialuronic acid，MDA）治療4周后，分別采用各試劑盒檢測各組大鼠SOD及MDA水平，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6.7 心肌組織PKC-βⅡ蛋白表達水平比較 取0.026 g心肌組織用冰預冷，PBS洗滌后放入均質儀中，加入300 μL RIPA裂解液反復研磨、裂解、離心，提取心肌組織中總蛋白。BCA法測蛋白濃度，取200 μL冷卻蛋白上清液按比例加入5×SDS蛋白變性液50 μL，沸水浴5 min后備用。制膠后加入上述變性的蛋白樣本進行電泳，電泳結束后轉膜，用PBST洗膜，室溫下封閉液封閉過夜，次日將膜與一抗（1:2 000）室溫孵育90 min，PBST洗3次，15 min/次，將稀釋后的二抗與膜共同室溫孵育90 min，PBST洗3次，10 min/次。使用ECL化學發(fā)光液與膜孵育1 min，用濾紙吸干殘余液體，封膜后在凝膠成像系統(tǒng)中成像，用Alpha軟件分析光密度值。

1.6.8 心肌組織病理改變情況 取心肌組織沖洗、烤片、切片并脫臘，蘇木素染10 min，蒸餾水沖洗，PBS返藍；伊紅染5 min，蒸餾水沖洗；梯度乙醇溶液（100%、100%、95%、85%、75%乙醇）脫水，每級5 min。取出后置于二甲苯中透明2次，10 min/次，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察病理變化。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以“均數(shù)±標準差”（±s）表示，滿足正態(tài)分布，方差齊多組間比較采用單因素方差分析，組間比較用LSD-t檢驗，方差不齊采用Games Howell檢驗；不滿足正態(tài)分布時采用Kruskal-Wallis H檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠治療前后體質量比較 治療前，與空白對照組比較，模型組、Rx抑制劑組和滋膵通脈飲高、低劑量組大鼠體質量均明顯降低（P＜0.05）。治療后，與空白對照組比較，模型組大鼠體質量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，Rx抑制劑組和滋膵通脈飲高、低劑量組大鼠體質量均明顯升高（P＜0.05）；與Rx抑制劑組比較，滋膵通脈飲高、低劑量組大鼠體質量均明顯升高（P＜0.05）。（見圖1）

圖1 各組大鼠治療前后體質量比較（±s，n=9）

2.2 各組大鼠治療前后空腹血糖比較 治療前，與空白對照組比較，模型組、Rx抑制劑組和滋膵通脈飲高、低劑量組大鼠空腹血糖均明顯升高（P＜0.05）。治療后，與空白對照組比較，模型組大鼠空腹血糖明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，Rx抑制劑組和滋膵通脈飲高、低劑量組大鼠空腹血糖均明顯降低（P＜0.05）；與Rx抑制劑組比較，滋膵通脈飲高、低劑量組大鼠空腹血糖明顯降低（P＜0.05），且滋膵通脈飲高劑量組大鼠空腹血糖與滋膵通脈飲低劑量組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見圖2）

圖2 各組大鼠治療前后空腹血糖水平比較（±s，n=9）

2.3 各組大鼠FINS、HOMA-IR和HbAlc比較 與空白對照組比較，模型組大鼠FINS、HOMA-IR和HbAlc均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，Rx抑制劑組和滋膵通脈飲高、低劑量組大鼠FINS、HOMA-IR和HbAlc均明顯降低（P＜0.05）；與Rx抑制劑組比較，滋膵通脈飲高、低劑量組大鼠FINS、HOMA-IR和HbAlc均明顯降低（P＜0.05）；滋膵通脈飲高劑量組大鼠FINS、HOMA-IR和HbAlc與滋膵通脈飲低劑量組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見圖3）

圖3 各組大鼠FINS、HOMA-IR 和HbAlc 比較（±s，n=9）

2.4 各組大鼠血脂水平比較 與空白對照組比較，模型組大鼠TG、T-CHO、LDL-C水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，Rx抑制劑組和滋膵通脈飲高、低劑量組大鼠TG、T-CHO、LDL-C水平均明顯均降低（P＜0.05）；與Rx抑制劑組比較，滋膵通脈飲高、低劑量組大鼠TG、T-CHO、LDL-C水平均明顯降低（P＜0.05）；滋膵通脈飲高劑量組大鼠TG、T-CHO、LDL-C水平與滋膵通脈飲低劑量組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見圖4）

圖4 各組大鼠血脂水平比較（±s，n=9）

2.5 各組大鼠MDA含量和SOD活性比較 與空白對照組比較，模型組大鼠MDA含量明顯升高（P＜0.05），而SOD活性明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，Rx抑制劑組和滋膵通脈飲高、低劑量組大鼠MDA含量均明顯降低（P＜0.05），而SOD活性均明顯升高（P＜0.05），且3組間大鼠MDA含量和SOD活性比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見圖5）

圖5 各組大鼠MDA 含量和SOD 活性比較（±s，n=9）

2.6 各組大鼠心肌組織PKC-βⅡ蛋白表達比較 與空白對照組比較，模型組大鼠心肌組織PKC-βⅡ蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，滋膵通脈飲低劑量組和Rx抑制劑組大鼠心肌組織PKC-βⅡ蛋白相對表達量均明顯降低（P＜0.01）；滋膵通脈飲高劑量組大鼠心肌組織PKC-βⅡ蛋白相對表達量與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見圖6～7）

圖6 各組大鼠心肌組織PKC-βⅡ蛋白表達Western blotting圖

圖7 各組大鼠心肌組織PKC-βⅡ蛋白相對表達量比較（±s，n=9）

2.7 各組大鼠心肌病理形態(tài)學改變 空白對照組大鼠心肌纖維與心肌細胞的排列整齊，纖維間隙未見明顯增寬，細胞核與細胞質著色均勻，對比清楚；模型組大鼠心肌纖維與心肌細胞排列紊亂，纖維間隙明顯增寬，心肌細胞肥大變形、可見炎癥細胞浸潤、間質纖維化明顯；滋膵通脈飲低劑量組和Rx抑制劑組大鼠心肌纖維與心肌細胞排列稍顯紊亂，纖維間隙較模型組增寬不明顯，細胞核染色基本清晰，細胞形態(tài)較為完整；滋膵通脈飲高劑量組心肌纖維與心肌細胞排列較紊亂，纖維間隙較模型組增寬不明顯，心肌細胞大部分變形，可見炎癥細胞浸潤、間質纖維化明顯。（見圖8）

圖8 各組大鼠心肌組織病理切片圖（HE，×100）

3 討 論

DCM發(fā)病機制復雜，心肌代謝紊亂及微血管損傷是導致DCM的關鍵[12]。糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗及高胰島素血癥均是DCM發(fā)生的獨立危險因素[13]，長期代謝紊亂引可起包括PKC激活、晚期糖基化終末產物增加、RAAS激活等多種生化改變，這些病理性異常共同促進DCM的發(fā)生與發(fā)展[14-15]。

PKC激活在DCM中發(fā)揮著非常重要作用，糖尿病時可通過多種途徑激活PKC[12,16-17]。糖尿病本身糖脂代謝紊亂及氧化應激增加均可激活PKC[13]，導致DCM發(fā)生及發(fā)展。目前已經發(fā)現(xiàn)PKC有至少12種亞型，其家族成員在結構、分布和底物結合上卻不盡相同。研究表明，PKC不同的亞型在糖尿病并發(fā)癥中可能發(fā)揮特異性的作用。PKC-β與心、腎及視網膜組織聯(lián)系緊密，并在其組織內廣泛表達，被認為是與DCM相關的一種主要的亞型[18]。目前研究顯示，DCM心肌組織中均存在PKC-β激活。PKC-β阻滯劑（LY333531）能夠抑制PKC-β激活，從而阻止或延緩糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生及發(fā)展[19-20]。

糖脂代謝異常是DCM產生的始動因素。維持心臟舒縮功能的主要因素為線粒體的正常供能，然而在此需滿足2個條件：燃料充足及本身結構、功能正常。心臟能量來源主要依賴于脂肪酸，其次是葡萄糖[21]。糖尿病可降低葡萄糖轉運蛋白的表達，降低葡萄糖利用率，導致糖代謝異常[22-23]。胰島素隨即升高，誘導脂肪酸轉位酶轉移至肌膜[24]。過量的脂質也通過提高PKC活性誘導脂肪酸轉位酶轉位[25]。胰島素抵抗時，葡萄糖轉運蛋白被抑制，進一步導致脂質攝取增加和葡萄糖轉運率下降[26]。高血糖狀態(tài)又將引起胰島素增加，如此往復，惡性循環(huán)。葡萄糖和脂肪酸被利用的平衡狀態(tài)被打破，脂肪酸產能高、產量高，脂質過載導致耗氧增高。缺氧狀態(tài)導致心肌收縮功能障礙、心肌肥大、心肌纖維化，甚則心肌細胞凋亡[24]。因此，改善糖脂代謝異常、高胰島素血癥及胰島素抵抗是治療此病的重要手段。

氧化應激被認為是DCM發(fā)展中的關鍵機制[27]，高血糖會激活氧化應激[28]。長期高血糖狀態(tài)通過激活蛋白激酶PKC途徑和晚期糖基化終產物，從而產生活性氧[29]。活性氧的積累，也可導致線粒體氧化損傷，攻擊其自身的蛋白質、DNA和脂質結構[30]，導致其呼吸鏈破壞，從而產生更多的活性氧?；钚匝蹩僧a生應激反應，引發(fā)炎癥、纖維化和細胞凋亡，加速糖尿病心肌病的發(fā)展。氮氧化合物的激活是內皮細胞中活性氧的主要來源[31]，高糖環(huán)境會增加氮氧化合物活性、活性氧釋放。然而異常的氮氧化合物激活可以促進一氧化氮合成酶失調和解偶聯(lián)，導致一氧化氮利用率降低，產生超氧化物，加重氧化應激及心肌損傷[32]。有研究表明，腫瘤壞死因子-α和高血糖均通過PKC活化氮氧化合物促進活性氧釋放和細胞凋亡[33]，說明PKC可活化氮氧化合物，導致一氧化氮合成酶解偶聯(lián)，從而促進氧化應激的產生。因此，PKC可作為改善氧化應激的治療靶點，這與本研究中Rx抑制劑組明顯改善了氧化應激的結果一致。

中醫(yī)學認為DCM歸屬于“消渴”繼發(fā)“胸痹”范疇[34]，統(tǒng)稱“消渴病心病”。消渴病多由先天稟賦不足，素體臟腑虛弱，或和后天飲食失節(jié)、情志不調、勞欲過度導致臟腑虛損而誘發(fā)。消渴纏綿日久化火，致氣陰兩虛，久則血漸難行，停而成瘀，阻滯心脈，終成消渴病心病[35]，因此，消渴病心病主要病機為氣陰兩虛、心脈瘀阻，以虛為本，以瘀為標，虛實夾雜。滋膵通脈飲是在張錫純的“滋膵飲”的基礎上加活血通絡藥物而成，是治療氣陰兩虛、瘀血阻絡之消渴及并發(fā)癥有效方劑。方中黃芪為補氣之主藥，山茱萸味酸澀納氣。兩藥合用，助肺、脾、腎以運氣、生氣、納氣，共為君藥。生地黃補腎陰，麥冬補肺陰，玄參補脾陰，天花粉清熱生津。四藥標本同治，共為臣藥。生蒲黃、丹參、川芎、水蛭化瘀為主，清熱為輔。地龍、鬼箭羽、僵蠶均主通絡助血行瘀散。七藥共為佐藥。山楂健胃消食，助脾胃吸收各藥之效，以達目的，為使藥。全方君臣佐使共同配合，益氣養(yǎng)陰，化瘀通絡?，F(xiàn)代研究表明，山茱萸的有效成分山茱萸總萜能調節(jié)糖尿病小鼠體內糖脂代謝過程，對糖尿病有治療作用[36]；玄參的有效成分玄參多糖對糖尿病大鼠有明顯的降血糖作用[37]；鬼箭羽具有降糖、降脂、保護心腦血管的作用[38-39]；丹參提取物丹參多酚酸鹽能降低糖尿病患者血糖，發(fā)揮血管保護作用，改善血管內皮功能[40]；川芎嗪可抑制細胞凋亡、調節(jié)氧化應激反應[41]；山楂的有效成分山楂葉總黃酮有明顯的降低糖尿病大鼠血脂、血糖的影響，而且還能改善糖尿病大鼠的抗氧化能力[42]。本研究結果顯示，治療前，模型組大鼠體質量及SOD活性均明顯降低，F(xiàn)BG、FINS、HOMA-IR、HbAlc、TG、T-CHO、LDL-C、MDA含量及PKC-βⅡ蛋白相對表達量均明顯升高，說明模型大鼠存在PKC-βⅡ的激活、糖脂代謝紊亂及氧化應激。治療后，與模型組比較，滋膵通脈飲高、低劑量組大鼠體質量及SOD活性均明顯升高，F(xiàn)BG、FINS、HOMA-IR、HbAlc、TG、T-CHO、LDL-C、MDA含量及PKC-βⅡ蛋白相對表達量均明顯降低；Rx抑制劑組大鼠SOD活性明顯升高，MDA含量及PKC-βⅡ蛋白相對表達量均明顯降低；與Rx抑制劑組比較，滋膵通脈飲高、低劑量組大鼠體質量升高，F(xiàn)BG、FINS、HOMA-IR、HbAlc、TG、T-CHO及LDL-C均明顯降低，而SOD活性及MDA含量與Rx抑制劑組無明顯差異，說明Rx抑制劑對DCM大鼠氧化應激及PKC-βⅡ激活有改善作用，滋膵通脈飲對DCM大鼠糖脂代謝、胰島素抵抗、氧化應激及PKC-βⅡ激活有改善作用，結果提示高劑量滋膵通脈飲效果欠佳，考慮為方劑中化瘀通絡藥物較多，高劑量則易傷脾胃，繼而影響藥效吸收所致。HE病理圖片結果亦表明Rx抑制劑及滋膵通脈飲可改善心肌纖維化。

綜上所述，滋膵通脈飲可改善糖尿病心肌病大鼠糖脂代謝及氧化應激，同時可抑制PKC-βⅡ表達抗心肌纖維化。