王偉杰 ，高 琦，孫正宇，王 聰，丁洋洋，黃浩東，康品方,2，唐 碧

心房顫動(atrial fibrillation，AF)是臨床上最常見的心律失常類型之一，隨著人口老齡化的發(fā)展，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。AF是導(dǎo)致心血管疾病的主要危險因素，其通過損害心臟功能顯著增加病人心力衰竭、卒中和血栓栓塞的發(fā)病率和死亡率。AF可分為陣發(fā)性AF(paroxysmal atrial fibrillation，PaAF)、持續(xù)性AF(persistent atrial fibrillation，PeAF)和永久性AF(permanent atrial fibrillation，PerAF)。AF發(fā)生的確切原因和機(jī)制尚不十分清楚，是目前研究的熱點(diǎn)。

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是導(dǎo)致AF發(fā)生的主要危險因素之一，2型DM(T2DM)是DM中最常見的類型，占DM病人90%以上，先前有研究表明，T2DM病人通過氧化應(yīng)激或炎癥反應(yīng)介導(dǎo)心房的結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)，繼而導(dǎo)致AF的發(fā)生[1]。血清基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)活性或表達(dá)增高會導(dǎo)致氧化應(yīng)激或炎癥反應(yīng)[2]。MMP增生、沉積是心肌纖維化的重要進(jìn)程[3]。動物試驗(yàn)表明，DM大鼠通過促進(jìn)心房纖維化、延長房間傳導(dǎo)時間，從而增加AF易感性[4]。因此，MMP9在T2DM病人AF的發(fā)生發(fā)展中可能有著重要作用。另外，有證據(jù)表明，抗氧化劑可通過激活磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)活性及其相關(guān)的信號通路，減輕DM大鼠的心房重構(gòu)，降低其AF的易感性[1]?？梢奝I3K在T2DM和AF之間的關(guān)系中可能起著非常重要的作用。

MMP9水平升高、PI3K水平降低均可介導(dǎo)不同程度的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[2]。目前對MMP9、PI3K的研究在T2DM病人AF疾病中的作用尚未有明確報道。左心房內(nèi)徑(LAD)作為描述以心臟大小及幾何形態(tài)改變?yōu)樘卣鞯男姆拷Y(jié)構(gòu)重構(gòu)指標(biāo)，已證實(shí)其與AF的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，因此可以將LAD增大作為AF發(fā)生的獨(dú)立危險因素。本研究通過測定血清中MMP9和PI3K的水平，探討血清MMP9和PI3K與已知預(yù)測因子LAD之間的關(guān)系，探索MMP9及PI3K在AF發(fā)生發(fā)展過程中的作用，為AF的診斷和預(yù)后評估提供一定的參考價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020-2021年蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院住院T2DM病人290例，其中200例為T2DM的AF病人，將AF病人分為3組，PaAF組62例，PeAF組70例，PerAF組68例。另外90例為心電圖正常的T2DM病人，稱為單純性DM組，作為對照組。病人入選標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)心電圖、24 h動態(tài)心電圖、心電事件記錄儀等明確記錄到AF發(fā)作；AF的分類依據(jù)2010 年歐洲心臟病學(xué)會(ESC)AF治療指南[5]。排除T2DM病人中合并各種感染性疾病、風(fēng)濕性心臟病、高血壓、心肌病、冠心病、甲狀腺功能亢進(jìn)及嚴(yán)重肝腎疾病。各組在性別、年齡、基礎(chǔ)疾病等因素上相互匹配。所有受試者簽署知情同意書，并獲得蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2019KY023)。

1.2 樣本準(zhǔn)備 標(biāo)本準(zhǔn)備：通宵禁食后的早上采集所有病人的外周血置于EDTA抗凝管中，2 h內(nèi)以2 000 r/min離心 10 min，取離心后的上層血漿，血漿置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 ELISA法檢測各組病人血清中MMP9及PI3K水平 使用 Human MMP9、PI3K檢測試劑盒，按ELISA廠家檢測說明，測定人血清MMP9、PI3K表達(dá)水平。操作步驟均嚴(yán)格遵循試劑自帶說明書執(zhí)行。檢測中嚴(yán)格質(zhì)控。

1.4 Western blotting檢測MMP9、PI3K蛋白在對照組和AF病人中的表達(dá)情況 使用已分裝好的血漿，加入 RIPA 后冰上裂解30 min，4 ℃離心機(jī)中15 000 r/min離心30 min，提取血漿總蛋白，根據(jù)BCA蛋白定量法說明書測各組蛋白濃度，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，95 ℃變性5 min，每組取40 μg蛋白，配置10% SDS-PAGE凝膠，根據(jù)計算所得體積上樣后電泳(60 V，30 min待Marker出現(xiàn)條帶分離后，調(diào)整為120 V，90 min待15 000相對分子質(zhì)量到達(dá)膠下緣是停止電泳)；轉(zhuǎn)膜(200 mA，2 h)至PVDF膜上； 5% BSA封閉液室溫封閉2 h；一抗4 ℃孵育過夜，內(nèi)參選用β-actin ；TBST洗滌3次，每次15 min；二抗室溫孵育2 h；TBST洗滌3次，每次15 min； ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.5 超聲心動圖檢查 所有受試者接受超聲心動圖檢查。排除結(jié)構(gòu)性心臟病，確定心房、心室有無血栓。測量LAD和左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用單因素方差分析、q檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)性分析和二元logistic回歸分析。ImageJ8.0軟件分析Western blotting條帶灰度值，Graphpad-prism8.3.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 病人臨床基線資料比較 各組研究對象的基本資料、肝腎功能、血常規(guī)、血脂等指標(biāo)間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組研究對象LVEF、LAD的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見表1)。

表1 4組受試者基線資料的比較

分組nPLT/(×109/L)Scr/(μmol/L)ALT/(U/L)AST/(U/L)LAD/mmLVEF/%對照組90210.29±42.0167.10±10.7921.64±11.0124.39±5.7937.43±3.1160.19±6.54PaAF組62211.39±53.3468.42±15.0224.38±12.2326.12±9.8740.10±3.0958.67±4.66PeAF組70210.12±40.6570.79±16.3224.19±12.2926.39±8.0742.81±2.0955.27±4.16PerAF組68207.00±40.1067.69±18.1924.01±12.1025.95±12.1144.57±3.2854.92±3.14F—0.120.860.970.8288.6720.96P—>0.05>0.05>0.05>0.05<0.01<0.01MS組內(nèi)—1931.395226.117140.36381.2778.62024.426

續(xù)表1

2.2 受試者血清MMP9及PI3K水平的比較 與對照組相比，PaAF、PeAF與PerAF組 MMP9 表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)、PI3K表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。與PaAF組相比，PeAF組與PerAF組 MMP9 表達(dá)水平升高(P<0.01)、PI3K表達(dá)水平降低(P<0.01)。與PeAF組相比，PerAF組 MMP9 表達(dá)水平升高(P<0.01)、PI3K表達(dá)水平降低(P<0.01)(見表2)。

表2 各組MMP9、PI3K水平比較

2.3 受試者血清MMP9、PI3K Western blotting檢測結(jié)果 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，PaAF、PeAF與PerAF組 MMP9 表達(dá)水平升高(P<0.01)、PI3K表達(dá)水平降低(P<0.01)。與PaAF組相比，PeAF組與PerAF組 MMP9 表達(dá)水平升高(P<0.01)、PI3K表達(dá)水平降低(P<0.01)。與PeAF組相比，PerAF組 MMP9 表達(dá)水平升高(P<0.01)、PI3K表達(dá)水平降低(P<0.01)(見圖 1、表3)。

表3 各組MMP9、PI3K蛋白表達(dá)水平比較

2.4 實(shí)驗(yàn)組血清MMP9、PI3k水平和LAD的相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson線性相關(guān)分析,實(shí)驗(yàn)組中MMP9水平與LAD呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.842，P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組中PI3k水平與LAD呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.868，P<0.05)。MMP9與 PI3k水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=0.913，P<0.01)。

2.5 二元logistic回歸分析 納入MMP9 、 PI3K和LAD行l(wèi)ogistic回歸分析(均以實(shí)測值賦值)，結(jié)果顯示MMP9 、 PI3K 、LAD 是 AF 的危險因素(見表4)。

表4 logistic 多因素回歸分析結(jié)果

3 討論

AF是最常見的持續(xù)性心律失常類型之一，其臨床危害大。DM是AF的獨(dú)立危險因素[2]，合并DM的AF病人其卒中、心衰發(fā)生率以及血管栓塞風(fēng)險等均增加[3-4]。且T2DM占DM病人90%以上，因此，探討闡明T2DM合并AF發(fā)生機(jī)制顯得尤為重要。有研究[5-6]報道，T2DM病人長期的高血糖水平、胰島素抵抗導(dǎo)致氧化應(yīng)激或炎癥反應(yīng)水平增高。而炎癥因子MMP9、PI3K水平的顯著異常均可引起氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[2]。因此，本研究在既往的研究基礎(chǔ)上，通過分析T2DM合并AF病人血清中MMP9、PI3K的表達(dá)水平及其與AF發(fā)生的關(guān)系，以期能夠?qū)F的早期診斷作出評估，為AF的臨床治療提供新思路。

MMPs是一個內(nèi)源性鋅依賴性酶家族，是降解 ECM的蛋白水解酶系統(tǒng)，MMPs激活可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中的幾乎所有的成分降解，介導(dǎo)正常組織和病理組織的重塑[7-9]。在MMPs家族中，MMP9與AF的關(guān)系最為密切，既往有學(xué)者報道，AF病人心房組織中MMP9表達(dá)水平較非AF病人組顯著增高[10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)，DM大鼠MMPs表達(dá)和活性增加，進(jìn)而引起心房的結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)，繼而導(dǎo)致AF的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，T2DM合并AF病人血清中MMP9表達(dá)水平較Con組顯著增高，另外，MMP9水平在PerAF組高于PeAF組高于PaAF組。本研究Western blotting中各蛋白表達(dá)量與上述趨勢符合，結(jié)果進(jìn)一步得到了證實(shí)。這也進(jìn)一步證明MMP9表達(dá)水平的增加與AF的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，其可能機(jī)制為，MMP9水平升高，MMP與組織抑制劑之間的平衡被破壞[12-13]，觸發(fā)并促進(jìn)心房ECM重塑和心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致AF的發(fā)生發(fā)展。

PI3K為一種心臟保護(hù)蛋白，具有心臟保護(hù)活性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，降低糖尿病心肌病小鼠心臟中的PI3K活性可加速DCM小鼠心力衰竭的進(jìn)展并導(dǎo)致其AF的發(fā)生發(fā)展[14-16]。既往有研究通過敲除小鼠的PI3K基因發(fā)現(xiàn)，其PI3K 活性降低，心房纖維化增加，心房鉀通道表達(dá)下調(diào)，AF易感性增加[17-19]。我們研究發(fā)現(xiàn)，T2DM合并AF病人血清中PI3K表達(dá)水平較對照組顯著增高；另外，血清PI3K水平在PerAF組低于PeAF組低于 PaAF組。本研究Western blotting中各蛋白表達(dá)量與上述趨勢符合，進(jìn)而提示了PI3K表達(dá)水平的降低與AF的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

MMP9、PI3K表達(dá)水平的異常均可介導(dǎo)不同程度的氧化應(yīng)激或炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致AF的發(fā)生[2]，本研究進(jìn)一步探討其與T2DM病人AF不同類型是否存在相關(guān)性。有研究表明,AF伴隨著持續(xù)的炎癥反應(yīng)、心肌組織損傷及修復(fù)過程，最終導(dǎo)致心腔發(fā)生慢性失代償性擴(kuò)大,LVEF明顯低于正常組， LAD明顯高于正常組[20-23]。本研究通過 Pearson相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)血清MMP9與LAD之間呈現(xiàn)一定正相關(guān)，PI3K與LAD之間呈現(xiàn)一定負(fù)相關(guān)，提示血清MMP9水平的升高、PI3K水平的降低可反映后期心腔擴(kuò)大。這些結(jié)果表明，MMP9和PI3K或通過調(diào)控心肌細(xì)胞的增殖、纖維化促進(jìn)心房重構(gòu)等，參與AF的發(fā)生發(fā)展。另外，我們對血清MMP9和PI3K行l(wèi)ogistic回歸分析，結(jié)果顯示二者均為T2DM病人AF的危險因素。故結(jié)合本文MMP9 在 AF 中的表達(dá)水平升高、PI3K在 AF 中的表達(dá)水平降低可顯示，其可能通過相關(guān)炎性通路使左心房發(fā)生慢性炎癥，增加了 AF 再發(fā)惡性事件的風(fēng)險。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)T2DM合并AF病人血清MMP9水平明顯升高，與AF的持續(xù)時間呈正相關(guān)；PI3K水平明顯降低，與AF的持續(xù)時間呈負(fù)相關(guān)。T2DM病人可能通過血清MMP9水平顯著升高、PI3K水平顯著降低介導(dǎo)氧化應(yīng)激水平增高和慢性炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致AF的發(fā)生發(fā)展，這有利于T2DM病人AF的早期診斷及嚴(yán)重程度的評估，為臨床防治提供了新的方向和廣闊前景。