李小榮，鮮 維，2，譚 鑫，陳永鋒，唐 碧，張 恒,康品方，王洪巨

肺動(dòng)脈高壓(PAH)是一種慢性進(jìn)行性疾病，是一種被定義為在海平面，靜息狀態(tài)下通過(guò)右心導(dǎo)管測(cè)定的平均肺動(dòng)脈壓超過(guò)25 mmHg的疾病，世界上大約有1%的人口都受到了PAH的影響[1-2]。缺氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是其中第三類(lèi)，它主要是由慢性缺氧所導(dǎo)致的例如慢性阻塞性肺疾病等。HPH的主要特征表現(xiàn)為肺血管的阻力增加，最終導(dǎo)致右心衰竭甚至死亡，是一種預(yù)后極差、對(duì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)極重的疾病[3-5]。遠(yuǎn)端小動(dòng)脈是HPH的主要靶點(diǎn)，它的主要病理特征是肺血管的重構(gòu)，血管壁表現(xiàn)出促增殖/抗凋亡和高代謝狀態(tài)，毛細(xì)血管前小動(dòng)脈肌化，并隨著時(shí)間的推移導(dǎo)致血管閉塞。其中血管內(nèi)皮損傷及平滑肌細(xì)胞增殖在肺血管的重構(gòu)中發(fā)揮著中重要作用[6-7]。目前雖然已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種治療PAH的藥物，但重度肺動(dòng)脈高壓病人的長(zhǎng)期預(yù)后仍然很差[8-9]。因此，我們亟需更多的研究靶點(diǎn)以求改善HPH預(yù)后并減輕醫(yī)療負(fù)擔(dān)。

線(xiàn)粒體乙醛脫氫酶(ALDH2)隸屬于乙醛脫氫酶家族，是一種位于線(xiàn)粒體基質(zhì)中的變構(gòu)四聚體酶，最早在肝臟中被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)研究[10-12]發(fā)現(xiàn)在心臟、大腦、腸道等多種器官中也大量表達(dá)。在多項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)ALDH2通過(guò)清除脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生的有毒醛，特別是4-HNE，在心肌損傷和中風(fēng)中發(fā)揮著保護(hù)作用。有研究證實(shí)ALDH2激活可減輕野百合堿誘導(dǎo)的PAH[13-14]，同時(shí)，XU等[15]研究發(fā)現(xiàn)ALDH2可能通過(guò)調(diào)控4-HNE的水平減輕HPH的發(fā)生。

自噬是將細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)傳遞到動(dòng)物細(xì)胞中的溶酶體或植物和酵母細(xì)胞中的液泡的所有途徑的總稱(chēng)。主要可分為三類(lèi)：巨自噬、微自噬以及分子伴侶介導(dǎo)的自噬。自噬分為三個(gè)過(guò)程：自噬起始、自噬膜延伸和自噬溶酶體形成[16-18]。Beclin1是自噬過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白之一，在自噬過(guò)程中，Beclin1在調(diào)節(jié)自噬小體膜的形成和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起著重要作用。Beclin1主要通過(guò)Atg14L-Vps15-Vps34信號(hào)軸調(diào)控巨自噬的起始[19]。微管相關(guān)蛋白 1A/1B 輕鏈 3B(MAP1 LC3)是微管相關(guān)蛋白，它們介導(dǎo)微管和細(xì)胞骨架成分之間的物理相互作用，通過(guò)泛素樣修飾參與自噬體液泡(自噬體)的形成。并且對(duì)于自噬體成熟的后期階段至關(guān)重要，同時(shí)它將線(xiàn)粒體消除降低到基礎(chǔ)水平以滿(mǎn)足細(xì)胞能量需求并防止過(guò)量活性氧自由基(ROS)產(chǎn)生從而參與線(xiàn)粒體自噬以調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體的融合與分裂[20-21]。SQSTM1(p62)是巨自噬所需的自噬受體。作為多泛素化自噬小體和溶酶體之間的橋梁。直接與降解的物質(zhì)和 MAP1 LC3 家族的自噬修飾劑相互作用，在自噬溶酶體的形成中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[22-23]。最近有研究表明，缺氧能夠通過(guò)促進(jìn)自噬的發(fā)生進(jìn)而激動(dòng)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)的增生與遷移，并且抑制自噬能夠有效的減緩野百合堿誘導(dǎo)的PAH的發(fā)生發(fā)展。

本研究擬用通過(guò)慢性缺氧構(gòu)建HPH動(dòng)物模型，同時(shí)使用Alda-1以及Daidzin分別激動(dòng)、抑制線(xiàn)粒體ALDH2，觀察肺組織病理改變，同時(shí)建立缺氧性肺動(dòng)脈高壓細(xì)胞模型，觀察PASMC細(xì)胞中自噬水平的變化，同時(shí)用CCK8檢測(cè)細(xì)胞的增殖水平、流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡，從而探究ALDH2、自噬與HPH的關(guān)系，為臨床通過(guò)ALDH2抑制自噬從而改善甚至治療HPH提供新的方法及思路。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和試劑 SD大鼠由蚌埠醫(yī)學(xué)院提供且符合動(dòng)物倫理；胰酶消化液(Gibco)；特級(jí)胎牛血清(BI)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco)；雙抗(Biosharp)；PBS緩沖液(Biosharp)；Alda-1(SML0462,Sigma-Aldrich)；Daidzin(Sigma-Aldrich)；ALDH2、Beclin、BLC3β、p62抗體購(gòu)自ABCAM；β-actin購(gòu)自Affinity；BCA試劑盒(碧云天)；T25培養(yǎng)瓶(Corning)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠HPH模型構(gòu)建 將雄性SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為4組：常氧組(N組)、常氧+Alda-1灌胃組(N+Alda-1組)、缺氧組(H組)、缺氧+Alda-1灌胃組(H+Alda-1組)，每組6只，按照晝12 h夜12 h規(guī)律光照培養(yǎng)，缺氧組以8 h/d，5天/周的10%±0.5%氧濃度進(jìn)行缺氧處理，4周過(guò)后游離出左下肺進(jìn)行HE染色觀察病理變化。

1.2.2 形態(tài)學(xué)檢測(cè) 將右下肺用PBS沖洗干凈后，4%多聚甲醛固定，然后依次使用低-高濃度乙醇脫水，再用二甲苯脫蠟，石蠟包埋。使用切片機(jī)(徠卡)切成約4 μm厚度切片，進(jìn)行HE染色，使用顯微鏡觀察并記錄，掃描并拍照觀察肺血管形態(tài)。

1.2.3 大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 取出生4～8周的SPF級(jí)SD大鼠，頸椎脫位法處死后用75%乙醇浸泡消毒10 min，然后將大鼠固定于紫外滅菌好的超凈工作臺(tái)中，用高壓滅菌的器械迅速分離出左下肺，用無(wú)菌PBS沖洗凈血液后固定在裝有無(wú)菌PBS的6 cm培養(yǎng)皿中。在體視顯微鏡下用無(wú)菌的眼科剪及眼科鑷小心分離出三四級(jí)肺動(dòng)脈，去除外膜后置于新鮮PBS中，用眼科剪剪開(kāi)血管，用無(wú)菌棉簽或者無(wú)菌手術(shù)刀輕輕刮去內(nèi)膜，并用眼科剪將血管在血清中剪成1 mm3大小。將血管組織塊均勻的分布到T25培養(yǎng)瓶中，緩慢吸出血清，將培養(yǎng)瓶倒置2 h后加入20%的完全培養(yǎng)基，約48 h可見(jiàn)組織周?chē)兴笮纹交∨莱觥?/p>

1.2.4 肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞鑒定 用免疫熒光對(duì)培養(yǎng)的肺動(dòng)脈平滑肌進(jìn)行鑒定。將培養(yǎng)瓶中的PASMCs消化后，取4萬(wàn)細(xì)胞接種于48孔板大小的爬片中，次日可進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)。用無(wú)菌PBS清洗細(xì)胞2次，1分鐘/次；4%的多聚甲醛室溫固定10 min，再用PBS洗3次，5分鐘/次；然后用5%BSA配制的0.3%的TritonX-100對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透及封閉1 h；用上述封閉液稀釋的α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白一抗過(guò)夜孵育PASMCs；次日用PBS清洗細(xì)胞3次，5分鐘/次；用封閉液配制的羊抗小鼠的FITC標(biāo)記的二抗避光孵育1 h；在避光條件下用PBS清洗細(xì)胞3次，5分鐘/次；將細(xì)胞爬片取出用濾紙吸取殘余液體，細(xì)胞面朝下蓋在滴加了含DAPI的抗熒光淬滅劑的載玻片上，封片后避光下用熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為6組：常氧組(N組)、常氧+Alda-1組(NA組)、缺氧組(H組)、缺氧+Alda-1組(HA組)、缺氧+Daidzin組(HD組)、缺氧+Alda-1+Daidzin組(HAD組)。

1.2.6 CCK8 取3 000對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PASMCs接種于96孔板中，干預(yù)后的細(xì)胞培養(yǎng)基中，按照體積100∶10的比例加入CCK8試劑，37 ℃孵育1 h后，利用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定吸光度，使吸光度值保持在1.0～2.0。

1.2.7 Annexin V/PI測(cè)定細(xì)胞凋亡 取10萬(wàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PASMCs接種于6孔板中，額外種3孔以做對(duì)照，干預(yù)結(jié)束后，使用1 mL 0.25%胰酶消化細(xì)胞，加入2 mL完全培養(yǎng)基終止消化后，輕輕吹打使細(xì)胞脫落，轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，去上清加入預(yù)先配置的Annexin V/PI室溫孵育30 min后，放置于冰上，使用流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，美國(guó)BD公司)測(cè)定細(xì)胞凋亡水平。

1.2.8 Western blotting檢測(cè)ALDH2、p62、LC3β蛋白表達(dá)情況 干預(yù)后的細(xì)胞用配置了1 mmol/L的PMSF的PBS洗滌后，向T25培養(yǎng)瓶加入1 mL 0.25%胰酶消化1 min，用3 mL 10%的完全培養(yǎng)基終止消化，將混合液離心，4 ℃ 1 000 r/min離心5 min；在沉淀中加入適量含有1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解30 min后離心，4 ℃ 12 000 g離心15 min；取上清，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白濃度；制備10%的聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣30 μg；濃縮膠用80 V恒壓電泳30 min，分離膠用120 V恒壓電泳90 min；將電泳好的凝膠置于三明治夾板中轉(zhuǎn)膜，220 mA恒流90 min電轉(zhuǎn)到PVDF膜上；5%脫脂奶粉室溫封閉90 min；用5%脫脂奶粉稀釋的一抗于4 ℃搖床孵育過(guò)夜；次日用TBST清洗條帶4次，5分鐘/次；用5%脫脂奶粉稀釋的二抗室溫孵育2 h，TBST清洗3次，10 分鐘/次；用ECL試劑盒曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用單因素方差分析(ANOVA)對(duì)多組間均數(shù)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理改變 HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)慢性缺氧處理過(guò)后，HC組的肺動(dòng)脈血管壁明顯增厚，可見(jiàn)中膜增厚，管腔變窄；通過(guò)Alda-1干預(yù)處理后，H+Alda-1組的血管壁厚度明顯減輕，同時(shí)缺氧所致的管腔狹窄也有所恢復(fù)(見(jiàn)圖1)。

2.2 原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果 PASMC免疫熒光顯示細(xì)胞核被DAPI染為藍(lán)色，α-SMA著色為綠色(見(jiàn)圖2)。結(jié)果可見(jiàn)，α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞率較高，提示細(xì)胞純度可用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

2.3 CCK8結(jié)果 CCK-8結(jié)果顯示，與N組相比，H組與HD組的細(xì)胞活性與增殖明顯增強(qiáng)(P<0.01)；與H組相比，HA組細(xì)胞增殖有所減少(P<0.01),HAD組細(xì)胞增殖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖3A)。

2.4 細(xì)胞凋亡水平 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與N組相比，H組細(xì)胞凋亡有少許增加，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；同時(shí)與H組相比，HA組和HAD組細(xì)胞增殖有所減少，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖3B、C)。

2.5 Western blotting檢測(cè)ALDH2、p62、Beclin1、LC3B蛋白表達(dá)情況 通過(guò)Image J對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析，與N組相比，H組與HD組的ALDH2表達(dá)降低(P<0.05)，自噬相關(guān)蛋白p62、Beclin1、LC3B均明顯升高(P<0.01)；與H組相比，HA組ALDH2表達(dá)明顯升高(P<0.01)，自噬相關(guān)蛋白p62、Beclin1、LC3B均降低(P<0.05)，HAD組的Beclin、LC3B蛋白差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖4)。

3 結(jié)論

肺小動(dòng)脈缺氧是PAH形成的重要因素，但其機(jī)制尚不完全明確[6]。在近年的研究中發(fā)現(xiàn)，PAH的主要病理變化體現(xiàn)在肺動(dòng)脈中內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙與肺動(dòng)脈平滑肌的異常增殖與收縮。其中在HPH中，肺動(dòng)脈中膜中PASMCs的增殖是肺血管重構(gòu)的最主要因素[24]。ALDH2是一種非細(xì)胞色素P450線(xiàn)粒體醛氧化酶，許多心血管疾病與氧化應(yīng)激和線(xiàn)粒體功能障礙有關(guān)。在ZHAO等[25]研究中發(fā)現(xiàn)，在慢性缺氧中，敲除ALDH2會(huì)加重小鼠的HPH進(jìn)展，并且ALDH2可能通過(guò)調(diào)控線(xiàn)粒體的分裂與融合對(duì)PASMCs的增殖有著一定的調(diào)控作用。因此，本研究擬通過(guò)慢性缺氧構(gòu)建大鼠HPH動(dòng)物模型，缺氧誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的SD大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞構(gòu)建HPH的細(xì)胞模型，以探討在HPH中PASMC增殖于凋亡失衡的可能因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物模型中，與N組相比，通過(guò)慢性缺氧處理后，肺組織中肺小動(dòng)脈血管管壁厚度明顯增加，尤以中膜為著，血管管壁也因此變窄；而與H組相比在Alda-1激活線(xiàn)粒體ALDH2后，病理切片結(jié)果顯示肺小動(dòng)脈血管管壁厚度明顯出現(xiàn)了明顯降低，并且因缺氧所導(dǎo)致的官腔狹窄也有所減輕。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示慢性缺氧處理能夠在大鼠中復(fù)制出HPH的模型，同時(shí)通過(guò)Alda-1激活線(xiàn)粒體ALDH2能夠?qū)PH發(fā)揮一定的治療效果。

有研究發(fā)現(xiàn)在MCT誘導(dǎo)的PAH中，AMPK 介導(dǎo)的mTOR 自噬信號(hào)通路參與細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)。在缺氧性肺動(dòng)脈高壓中，自噬水平也明顯升高[26-27]。這些結(jié)論與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，經(jīng)過(guò)缺氧處理后，PASMCs中的ALDH2水平明顯降低，自噬相關(guān)蛋白p62、Beclin1及MAP1 LC3B水平顯著升高，說(shuō)明自噬在PAH的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。同時(shí)在Alda-1組孵育過(guò)后，ALDH2水平升高，自噬相關(guān)蛋白p62、Beclin1及MAP1 LC3B的表達(dá)均有下降，提示激活A(yù)LDH2能夠有效降低PAH中自噬的水平。在既往自噬的研究中，往往認(rèn)為Beclin1及LC3B參與了自噬的發(fā)生與自噬膜的延長(zhǎng)，并且該蛋白的表達(dá)水平與自噬水平呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，而p62參與自噬中自噬小體與溶酶體的結(jié)合以及降解的過(guò)程，該蛋白的表達(dá)量與自噬水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，本研究中的結(jié)果顯示，在缺氧時(shí)PASMCs中Beclin1、LC3B及p62水平均升高，提示可能缺氧可以促進(jìn)PASMCs的自噬發(fā)生，但是對(duì)自噬溶酶體的降解產(chǎn)生了抑制。

研究表明,適度的自噬可以導(dǎo)致細(xì)胞遷移和平滑肌細(xì)胞的增殖，用聲波刺猬蛋白治療平滑肌細(xì)胞可誘導(dǎo)自噬并增加細(xì)胞增殖；此外，通過(guò)PDGF誘導(dǎo)的自噬與平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移密切相關(guān)，同時(shí)，利用3-MA抑制自噬可以減少細(xì)胞的增殖[28-29]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，與常氧組相比，缺氧處理后的細(xì)胞內(nèi)自噬水平明顯升高，同時(shí)CCK8與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，通過(guò)缺氧處理后，PASMCs的活性與增殖能力明顯增加，凋亡水平雖有所降低，但變化并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而與缺氧組相比，在通過(guò)Alda-1激活線(xiàn)粒體ALDH2后，細(xì)胞內(nèi)自噬水平顯著降低，PASMCs的增殖也明顯受到抑制，細(xì)胞凋亡雖有所增加，但是通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果提示線(xiàn)粒體ALDH2可能通過(guò)對(duì)自噬水平的調(diào)控，進(jìn)而主要通過(guò)降低PASMCs的增殖水平而非調(diào)控凋亡的水平，從而改善HPH的病理改變。

綜上所述，線(xiàn)粒體ALDH2可能通過(guò)對(duì)自噬的調(diào)控，進(jìn)一步調(diào)節(jié)了PASMCs的增殖，進(jìn)而改善HPH的病理進(jìn)程，而通過(guò)激活線(xiàn)粒體ALDH2在一定程度上可以改善肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展。