魏 晴，何蘭鳳，鄭 雙，梁珊珊，孫慶文

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 大果木姜子研究中心，貴州 貴陽 550025；3.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 植物多糖研究中心，貴州 貴陽 550025)

米槁(CinnamomummigaoH.W.Li)為樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)常綠喬木。大果木姜子為米槁的干燥成熟果實，是貴州苗族民間常用藥物，最早收錄于《本草綱目拾遺》。大果木姜子具有驅(qū)散、疏通中焦寒氣而止痛的作用，臨床常用來治療因寒邪阻滯而引起的胸腹部疼痛[1]。但大果木姜子產(chǎn)量低、體積小、不易采摘。目前對米槁果實的化學(xué)成分和藥理學(xué)研究比較深入[2-4]，但對米槁其它部位如葉、種子等的研究較少。

多糖與蛋白質(zhì)功能相似，作為生命活動中不可缺少的大分子，在免疫系統(tǒng)中起著重要的作用[5-9]。傳統(tǒng)的多糖提取工藝存在耗時長、溶劑用量大、工藝復(fù)雜等缺點，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。因此，需要開發(fā)一種操作簡單、高效的多糖提取工藝。由于單一評價指標(biāo)不足以全面反映多糖提取工藝的優(yōu)化結(jié)果，故選取多個指標(biāo)綜合評價多糖提取工藝[10]。作者以米槁葉為研究對象，以米槁葉得膏率、多糖含量和抗氧化活性為評價指標(biāo)，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用總評歸一-響應(yīng)面法優(yōu)化米槁葉多糖的提取工藝，為米槁葉的開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

米槁葉，采摘于貴州省羅甸縣，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院孫慶文教授鑒定為米槁(CinnamomummigaoH.W.Li)的葉。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%，批號MB6951)，大連美侖生物技術(shù)有限公司；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，純度>99%)，美國Sigma公司；苯酚、無水乙醇，分析純，西隴科學(xué)。

UV1100型紫外可見分光光度計，上海赫爾普儀器有限公司；KQ-3200E型超聲波清洗儀，青島精誠儀器儀表有限公司。

1.2 米槁葉的前處理

取新鮮的米槁葉，除去多余的枝梗和雜質(zhì)，置于室內(nèi)通風(fēng)處陰干后，粉碎，過40目篩，得到米槁葉粉末。

1.3 米槁葉多糖提取工藝的優(yōu)化

以得膏率、多糖含量和抗氧化活性等3個指標(biāo)對米槁葉多糖提取工藝進行綜合評價。采用Hassan法歸一化處理得膏率、多糖含量、抗氧化活性這3個指標(biāo)[11]，所有指標(biāo)最終通過總評歸一值(OD)進行評價。

1.3.1 單因素實驗

采用單因素實驗，分別考察提取時間(25 min、30 min、35 min、40 min、45 min)、提取功率(40 W、60 W、80 W、100 W、120 W)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1，mL∶g，下同)、提取次數(shù)(1、2、3、4、5)、提取溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)對米槁葉得膏率、多糖含量、抗氧化活性的影響。

1.3.2 響應(yīng)面實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取提取時間、提取功率、液料比為考察因素，以O(shè)D值為評價指標(biāo)，設(shè)計響應(yīng)面實驗，進一步優(yōu)化米槁葉多糖的提取工藝。

1.4 檢測方法

1.4.1 得膏率的測定

參照文獻[12-13]方法測定得膏率。將潔凈蒸發(fā)皿置于105 ℃恒溫干燥箱中干燥至恒重(m0)，精密量取提取液10 mL，置于蒸發(fā)皿中水浴蒸干，再于105 ℃干燥至恒重，冷卻30 min后，迅速精密稱重(m)。按式(1)計算得膏率：

(1)

式中：V為提取液體積，mL；W為米槁葉粉末樣品質(zhì)量，g。

1.4.2 多糖含量的測定

參照文獻[14-15]方法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.02 mg，置于105 ℃恒溫干燥箱中干燥至恒重，移入50 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容，得到0.20 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)母液；然后將標(biāo)準(zhǔn)母液依次稀釋得到0.10 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.025 mg·mL-1、0.012 5 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，加入6%苯酚溶液1 mL，混勻，再迅速加入5 mL濃硫酸，搖勻后冷卻至室溫，以1 mL蒸餾水作為空白對照，測定490 nm處吸光度。以葡萄糖濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得到線性回歸方程為：A=8.201c+0.05327，R2=0.9994。

參照文獻[16-17]方法測定米槁葉多糖含量。取提取液0.1 mL，加入0.9 mL蒸餾水、1 mL 6%苯酚溶液，搖勻，迅速加入5 mL濃硫酸，搖勻后冷卻至室溫，測定其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算提取液中的多糖含量，按式(2)計算多糖含量：

(2)

式中：c為提取液中的多糖含量，mg·mL-1；n為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；W為米槁葉粉末樣品質(zhì)量，mg。

1.4.3 抗氧化活性的測定

通過測定米槁葉多糖對DPPH自由基的清除率評價其抗氧化活性。參照文獻[18]方法，取提取液2 mL，加入2 mL DPPH自由基工作液，搖勻，避光靜置30 min，測定517 nm處吸光度，平行測定3次，取平均值。按式(3)計算DPPH自由基清除率：

(3)

式中：A0為DPPH自由基工作液的吸光度；A1為提取液+DPPH自由基工作液的吸光度；A2為提取液的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 提取時間的影響(表1)

表1 提取時間對米槁葉得膏率、多糖含量和抗氧化活性的影響Tab.1 Effect of extraction time on extraction rate of solid extracts,polysaccharides content,and antioxidant activity of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

由表1可知，隨著提取時間的延長，得膏率、多糖含量、DPPH自由基清除率均逐漸升高；當(dāng)提取時間為40 min時，各指標(biāo)達到最高；當(dāng)提取時間繼續(xù)延長至45 min時，各指標(biāo)略有下降?？赡苁怯捎?，提取時間過長，米槁葉中其它成分被提取出來，導(dǎo)致多糖占比降低、抗氧化活性下降。因此，提取時間選擇40 min較為適宜。

2.1.2 提取功率的影響(表2)

表2 提取功率對米槁葉得膏率、多糖含量和抗氧化活性的影響Tab.2 Effect of extraction power on extraction rate of solid extracts,polysaccharides content,and antioxidant activity of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

由表2可知，隨著提取功率的增大，得膏率、多糖含量、DPPH自由基清除率均逐漸升高；當(dāng)提取功率為80 W時，各指標(biāo)達到最高；當(dāng)提取功率繼續(xù)增大至100 W后，各指標(biāo)略有下降?？赡苁怯捎?，提取功率過大，多糖結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致多糖含量下降、抗氧化活性降低。因此，提取功率選擇80 W較為適宜。

2.1.3 液料比的影響(表3)

表3 液料比對米槁葉得膏率、多糖含量和抗氧化活性的影響Tab.3 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of solid extracts,polysaccharides content,and antioxidant activity of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

由表3可知，隨著液料比的增大，即提取溶劑用量的增加，得膏率、多糖含量、DPPH自由基清除率均逐漸升高；當(dāng)液料比為30∶1時，各指標(biāo)達到最高；當(dāng)液料比繼續(xù)增大至40∶1后，各指標(biāo)略有下降?？赡苁怯捎冢崛∪軇┯昧窟^多，更多其它成分被溶出，導(dǎo)致多糖含量下降、抗氧化活性降低。因此，液料比選擇30∶1較為適宜。

2.1.4 提取次數(shù)的影響(表4)

表4 提取次數(shù)對米槁葉得膏率、多糖含量和抗氧化活性的影響Tab.4 Effect of extraction times on extraction rate of solid extracts,polysaccharides content,and antioxidant activity of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

由表4可知，隨著提取次數(shù)的增加，得膏率略有升高，多糖含量、抗氧化活性先略微升高而后降低，總體變化不大。綜合考慮，提取次數(shù)選擇1次較為適宜。

2.1.5 提取溫度的影響(表5)

由表5可知，隨著提取溫度的升高，得膏率、多糖含量、DPPH自由基清除率均逐漸升高；當(dāng)提取溫度為60 ℃時，各指標(biāo)達到最高；當(dāng)提取溫度繼續(xù)升至70 ℃后，各指標(biāo)均明顯下降。因此，提取溫度選擇60 ℃較為適宜。

表5 提取溫度對米槁葉得膏率、多糖含量和抗氧化活性的影響Tab.5 Effect of extraction temperature on extraction rate of solid extracts,polysaccharides content,and antioxidant activity of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

響應(yīng)面實驗的因素與水平見表6，設(shè)計與結(jié)果見表7。

表6 響應(yīng)面實驗的因素與水平Tab.6 Factors and levels of response surface methodologies

表7 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果Tab.7 Design and results of response surface methodologies

2.2.2 回歸模型的建立與方差分析

對實驗結(jié)果進行擬合，得到回歸方程為：OD值=0.96-0.039A+0.092B+0.086C+(2.350E-003)AB+(6.250E-004)AC-0.11BC-0.26A2-0.24B2-0.46C2。

對回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表8。

表8 方差分析Tab.8 Analysis of variance

由表8可知，模型的P<0.0001，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；失擬項F=6.02，P=0.0578>0.05，不顯著，說明該模型擬合度較好。一次項B、C，二次項BC，交互項A2、B2、C2對OD值的影響極顯著。進一步比較F值可知，各因素對米槁葉多糖提取的影響大小順序為：提取功率(B)>液料比(C)>提取時間(A)。

2.2.3 響應(yīng)面分析

各因素交互作用對OD值影響的響應(yīng)面圖及等高線圖見圖1。

由圖1可知，提取功率與液料比的響應(yīng)曲面較陡，且等高線呈橢圓，說明兩者交互作用對OD值影響較大，與方差分析結(jié)果一致。由方程得到米槁葉多糖的最佳提取工藝為：提取時間39.33 min、提取功率77.30 W、液料比28.67∶1，在此條件下，OD值為0.956 0。

圖1 各因素交互作用對OD值影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.1 Response surface plots and contour plots for interaction between various factors on OD value

2.3 工藝驗證

考慮到實際可操作性，將米槁葉多糖的最佳提取工藝調(diào)整為：提取時間40 min、提取功率80 W、液料比30∶1。在此條件下進行3次平行驗證實驗，OD平均值為0.957 1，與預(yù)測值(0.956 0)的相對偏差為0.11%，米槁葉多糖含量為3.42%。說明該模型預(yù)測性較好，多指標(biāo)評價優(yōu)化的米槁葉多糖提取工藝可行。

3 結(jié)論

以米槁葉得膏率、多糖含量和抗氧化活性為評價指標(biāo)，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用總評歸一-響應(yīng)面法優(yōu)化了米槁葉多糖的提取工藝。確定最佳提取工藝為：提取時間40 min、提取功率80 W、液料比30∶1(mL∶g)，在此條件下，OD值為0.957 1，米槁葉多糖含量為3.42%。該研究為開發(fā)米槁新的藥用部位提供了理論依據(jù)。