管圣迪，蘇穎軒，李夢莉，羅海梅，于 妍

(中國礦業(yè)大學(xué)(北京)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100083)

我國經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展，能源需求迅速增長，能源供需矛盾日益突出，非常規(guī)能源越來越受到人們的重視[1]。但是頁巖氣開采造成土壤中石油含量增加，顯著影響微生物群落，導(dǎo)致土壤微生物數(shù)量減少及生物多樣性降低[2]。土壤微生物是土壤的重要組成部分，其種類較多，在土壤的形成發(fā)育、物質(zhì)循環(huán)和肥力演變等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。頁巖氣開采造成的土壤污染具有隱蔽性、滯后性、累積性、不可逆轉(zhuǎn)性等特點[3]。因此，切實有效地解決石油污染土壤的修復(fù)問題，成為國內(nèi)外研究的熱點[4]。石油污染土壤的修復(fù)技術(shù)主要有物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)[5]。其中，生物修復(fù)技術(shù)因具有成本低、幾乎不產(chǎn)生二次污染和可進(jìn)行原位修復(fù)等優(yōu)點而受到廣泛關(guān)注[6-8]。

延長油氣田位于鄂爾多斯盆地，鄂爾多斯盆地延長組長 7 段烴源巖分布廣泛，處于生油窗后期——生濕氣窗的高峰期[9]，油氣共生，部分成熟度較高的區(qū)域產(chǎn)氣強(qiáng)度較大，具備頁巖氣成藏的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此，頁巖氣開采發(fā)展迅速。但在頁巖氣開采過程中產(chǎn)生的油基巖屑會污染土壤[10]。2015年，我國出臺了禁止油基巖屑落地的政策，因此后期沒有新增石油污染土壤，但是了解石油污染土壤的污染現(xiàn)狀對于指導(dǎo)土壤生物修復(fù)具有重要意義。 基于此，作者采集延長某頁巖氣井田場地老化石油污染土壤，以周圍未受石油污染土壤作為對照，利用 MiSeq 高通量測序技術(shù)分析土壤微生物群落多樣性，采用冗余分析(RDA)探究微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子的關(guān)系，為探究土壤微生物對石油的耐性機(jī)制、開發(fā)土壤修復(fù)技術(shù)提供理論支撐。

1 實驗

1.1 土壤樣品采集

2020年10月在陜西省延長某頁巖氣井田場地按照棋盤布點法設(shè)置6個點位，每個點位采集50 cm×50 cm小樣方的四角及中心0～20 cm深的土壤樣品，混合得到該點位的土壤樣品，依次編號為YC1～YC6；同時在井田場地外采集未污染土壤樣品作為對照，編號為YC。所有土壤樣品剔除草根和石塊后儲存于采樣袋內(nèi)，置于裝有冰袋的恒溫箱中，立即帶回實驗室4 ℃保存，用于微生物高通量測序的土壤樣品于-80 ℃下保存。

1.2 土壤樣品的理化性質(zhì)分析

將采集的土壤樣品自然風(fēng)干，研磨過篩，采用火焰原子吸收分光光度法測定總鉻，采用石墨爐原子吸收分光光度法測定鉛，采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗分光光度法測定有效磷，采用重鉻酸鉀氧化-分光光度法測定有機(jī)碳，采用凱氏定氮法測定總氮，采用電位法測定pH值，采用重量法測定含水率和含鹽量，采用氣相色譜法測定石油烴。采用SPSS 22軟件對土壤樣品的各項理化指標(biāo)的變化量進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.3 微生物DNA的提取及高通量測序

對土壤樣品進(jìn)行預(yù)處理，用DNA提取試劑盒(E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit，Omega)提取DNA。對樣本進(jìn)行質(zhì)檢，樣本濃度在6.04～24.60 ng·μL-1之間。采用16S rRNA通用引物341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)、805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)對V3-V4區(qū)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在第二輪擴(kuò)增中引入Illumina橋式PCR兼容引物。最后，在MiSeq平臺對16S rRNA的V3-V4高變區(qū)進(jìn)行高通量測序。

1.4 測序數(shù)據(jù)分析

對MiSeq測序所得原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，區(qū)分樣本后對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，然后對所得操作單元(operational taxonomic unit，OTU)進(jìn)行聚類分析和物種分類學(xué)分析?；贠TU聚類分析結(jié)果，對OTU進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析，計算alpha多樣性指數(shù)(Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)等)，以表征微生物群落多樣性，鑒別采樣點的石油降解優(yōu)勢菌屬。利用R語言繪制OTU聚類韋恩圖、聚類堆積柱狀圖，并對優(yōu)勢菌門、菌屬的豐度與理化性質(zhì)進(jìn)行冗余分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤樣品的理化性質(zhì)(表1)

表1 土壤樣品的理化性質(zhì)Tab.1 Physicochemical properties of soil samples

采樣點地處西北，干旱少雨，鹽堿積累，土壤的pH值和含鹽量高。由表1可知，污染土壤樣品的pH值范圍在8.45～9.98之間，均高于未污染土壤樣品；污染土壤樣品的有機(jī)碳含量在0.81～5.18 g·kg-1之間，均高于未污染土壤樣品；未污染土壤樣品的含鹽量較低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于污染土壤樣品，但含水率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于污染土壤樣品，主要是因為石油具有疏水性，石油污染土壤的疏水性也隨之升高，導(dǎo)致土壤儲水能力下降，含水率除低[11]；污染土壤樣品的鉛含量在3.03～17.10 mg·kg-1之間；污染土壤樣品的石油烴含量在38.81～320.69 mg·kg-1之間，均高于未污染土壤樣品，其中YC4樣品的石油烴含量最高，是未污染土壤樣品的40倍左右。石油烴含量較高的土壤樣品(YC1、YC3、YC4、YC6)的碳氮比失衡，均高于100/10，主要是由于陜北地區(qū)黃綿土氮含量低，碳含量高，導(dǎo)致碳氮比較高[12]。

將污染土壤樣品與未污染土壤樣品的理化性質(zhì)進(jìn)行Person相關(guān)性分析，結(jié)果見表2。

表2 土壤理化性質(zhì)的Person相關(guān)性分析Tab.2 Person correlation analysis of physiochemical properties of soil

由表2可知，pH值與有機(jī)碳含量呈極顯著負(fù)相關(guān)性，總氮含量與有效磷含量、鉛含量與石油烴含量均呈極顯著正相關(guān)性，有效磷含量與含水率呈顯著正相關(guān)性，其它指標(biāo)間的相關(guān)性不顯著。

2.2 微生物群落多樣性分析

2.2.1 OTU聚類分析(圖1)

圖1 OTU聚類韋恩圖Fig.1 Clustering Venn diagram of OTU

由圖1可知，7個土壤樣品共同含有532個 OTU。OTU數(shù)量順序為：YC>YC6>YC3>YC1>YC4>YC5≈YC2，其中YC樣品含有的OTU數(shù)量最多，YC5和YC2樣品含有的OTU數(shù)量最少，說明石油污染土壤中微生物數(shù)量減少，主要是受石油污染物的脅迫和環(huán)境因素的影響[13]。

2.2.2 多樣性指數(shù)分析

在97%相似度水平下，計算alpha多樣性指數(shù)，結(jié)果見表3。

表3 alpha多樣性指數(shù)Tab.3 alpha Diversity index

Chao1指數(shù)和 Shannon指數(shù)反映了微生物群落的豐富度和多樣性，數(shù)值越大說明群落豐富度和多樣性越高； Simpson 指數(shù)反映了微生物群落的均勻性，數(shù)值越小，說明群落分布越均勻。由表3可知，YC和YC6樣品的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)較大，說明微生物群落豐富度和多樣性較高；YC樣品的Simpson 指數(shù)最小，說明未污染土壤樣品的微生物群落均勻性高于污染土壤樣品。對比發(fā)現(xiàn)，石油烴的攝入降低了土壤微生物豐富度，石油烴含量越高，多樣性越低，群落分布越不均勻。

2.2.3 石油降解微生物優(yōu)勢菌落分析

門水平物種相對豐度如圖 2 所示。

圖2 門水平物種相對豐度聚類堆積柱狀圖Fig.2 Clustering accumulation histogram of relative abundance of major microbial species at phylum level

由圖2可知，變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度最高，為優(yōu)勢菌門，廣泛存在于石油污染土壤中，說明其對老化石油污染土壤環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)性；放線菌門(Actinobacteria)在7個樣品中同樣表現(xiàn)出了豐度優(yōu)勢；此外，酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)在7個樣品中均有一定豐度。污染土壤樣品中， YC3樣品與其它樣品在門水平上有較大的差異，其余樣品微生物組成略有差異，YC2與YC6樣品在門水平上一致。相較于YC樣品，由于石油烴類污染物的攝入，變形菌門、綠彎菌門(Chloroflexi)的相對豐度明顯上升，其中石油烴含量較高的YC4樣品中變形菌門微生物的增加尤為明顯，而放線菌門的相對豐度有所降低。表明在石油污染土壤的老化過程中，變形菌門微生物增多，而放線菌門微生物減少。

當(dāng)土壤被石油烴污染時，相對豐度顯著升高或新出現(xiàn)的細(xì)菌可以被視為石油烴降解菌(嗜油性細(xì)菌)，而相對豐度顯著降低的細(xì)菌可以被視為疏油性細(xì)菌[14]。因此推斷延長地區(qū)嗜油性菌門為變形菌門和綠彎菌門，這與遼河石油污染土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的研究[15]及陜北石油污染土壤微生物多樣性的研究[16]結(jié)果一致。

將相對豐度前15的物種進(jìn)行屬水平分析，結(jié)果如圖 3 所示。

圖3 屬水平物種相對豐度聚類堆積柱狀圖Fig.3 Clustering accumulation histogram of relative abundance of major microbial species at genus level

由圖3可知，未污染土壤樣品與污染土壤樣品中優(yōu)勢菌群組間差異較大。不同采樣點屬水平上群落結(jié)構(gòu)有差異，其中YC2與YC6樣品在屬水平上相似性最高。根據(jù)各樣品理化性質(zhì)，可以看出屬水平相似性較高的樣品，其pH值、有機(jī)碳含量相似性最高。污染土壤樣品中主要菌屬有鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、Saccharibacteria_genera_incertae_sedis、芽孢桿菌屬(Bacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、交替紅色桿菌屬(Altererythrobacter)、諾卡氏菌屬(Nocardioides)。

對屬水平占比較高的優(yōu)勢菌群進(jìn)行功能性分析，結(jié)果見表4。

表4 占比較高的優(yōu)勢菌群的功能性分析Tab.4 Functional analysis of dominant bacteria with relatively high proportion

石油烴降解菌能將碳?xì)浠衔镛D(zhuǎn)化為能源、生物質(zhì)及生物廢料副產(chǎn)品[26]。石油污染土壤樣品中，共有7個屬具有石油烴類污染物降解功能，其中諾卡氏菌屬和芽孢桿菌屬可產(chǎn)表面活性劑，降低石油烴類污染物表面張力，實現(xiàn)其乳化和增溶；鞘氨醇單胞菌屬含有一組獨特的芳香化合物降解基因，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞表面疏水性來適應(yīng)石油污染環(huán)境。

假單胞菌屬(Pseudomonas)、紅球菌屬(Rhodococcus)、微桿菌屬(Microbacterium)、芽孢桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬等是常見的石油烴降解菌[22]。王耀民[27]從大港油田長期被原油污染的土壤中分離、篩選出4 株能以原油為唯一碳源的菌株，其中2株原油降解率高的菌株分別為不動桿菌屬和芽孢桿菌屬。

2.2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子的關(guān)系

微生物群落結(jié)構(gòu)是土壤微生態(tài)環(huán)境的響應(yīng)，要結(jié)合理化指標(biāo)進(jìn)行分析。對7個土壤樣品微生物門和屬水平與理化性質(zhì)進(jìn)行冗余分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 微生物門水平(a)、屬水平(b)冗余分析Fig.4 Redundancy analysis of microorganism at phylum level(a) and genus level(b)

由圖4a可知，第一主軸和第二主軸分別解釋了總方差變量的45.38%和30.21%，第一主軸上總氮含量是主要的影響因子，第二主軸上pH值和總鉻含量是主要的影響因子。其中pH值、總氮含量、總鉻含量是微生物門水平的主要影響因子，石油烴含量也對微生物門水平有影響，尤其是與變形菌門具有顯著的正相關(guān)性。土壤中微生物數(shù)量最多的變形菌門受pH值的影響較大。鉛含量與石油烴含量存在顯著的相關(guān)性，說明石油污染會導(dǎo)致土壤中重金屬含量升高，進(jìn)而加重土壤污染，與Person相關(guān)性分析(表2)結(jié)果一致。受石油烴的影響，微生物菌門在結(jié)構(gòu)上會發(fā)生變化， 其中YC2與YC6樣品的菌門結(jié)構(gòu)相似性高，其微生物菌門主要受石油烴含量、鉛含量、pH值的影響；YC4樣品主要受總氮含量的影響；YC1與YC5樣品的菌門結(jié)構(gòu)相似性較高，與門水平聚類堆積柱狀圖(圖2)結(jié)果一致。

由圖4b可知，第一主軸和第二主軸分別解釋了總方差變量的45.88%和27.69%。第一主軸上pH值、鉛含量、石油烴含量是主要的影響因子，第二主軸上石油烴含量和總鉻含量是主要的影響因子，因此，與微生物群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性較高的土壤理化指標(biāo)是石油烴含量、pH值和重金屬含量。Saccharibacteria_genera_incertae_sedis、分枝桿菌屬與石油烴含量存在顯著正相關(guān)性，推測其對石油烴具有良好的降解潛能；分枝桿菌屬與鉛含量具有顯著正相關(guān)性，其對鉛具有良好的降解性能；鞘氨醇單胞菌屬與pH值具有顯著正相關(guān)性，與石油烴含量具有正相關(guān)性，與荊佳維等[13]的研究結(jié)果一致。Gp3、短波單胞桿菌屬(Brevundimonas)與總鉻含量存在顯著正相關(guān)性，推測其對總鉻有降解能力。YC1、YC2、YC5、YC6樣品的菌屬相似性較高，YC3、YC4樣品與其它樣品不同，未污染土壤與污染土壤樣品的菌屬差異性大。

3 結(jié)論

利用 MiSeq 高通量測序技術(shù)分析了延長某頁巖氣井田場地老化石油污染土壤的微生物群落多樣性，采用冗余分析探究了微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子的關(guān)系，結(jié)論如下：

(1)石油污染土壤偏堿性，土壤污染不均勻，石油烴含量差異較大，由于石油烴污染造成碳氮比失衡，氮含量不足。

(2)石油污染土壤微生物的優(yōu)勢菌門為變形菌門和放線菌門；鞘氨醇單胞菌屬、分枝桿菌屬、Saccharibacteria_genera_incertae_sedis、芽孢桿菌屬、節(jié)桿菌屬、交替紅色桿菌屬和諾卡氏菌屬等 7 種菌屬具有石油烴類污染物降解功能，分枝桿菌屬和短波單胞桿菌屬具有重金屬降解功能。

(3)石油污染土壤微生物的多樣性和均勻度均有所下降，石油污染會導(dǎo)致鞘氨醇單胞菌屬、分枝桿菌屬、芽孢桿菌屬等菌屬的相對豐度有所上升。

(4)石油污染土壤微生物群落多樣性主要受pH值、石油烴含量和重金屬含量的影響，鉛含量與石油烴含量存在顯著正相關(guān)性，說明石油烴的攝入會導(dǎo)致土壤中重金屬含量上升、營養(yǎng)失衡，進(jìn)而加重土壤污染。