張珊滋，王春燕，丁文歡，賀 元，李安林，郭 瑛，田 莉.2*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830011)

全球惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率不斷升高，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康。癌癥的病因復(fù)雜，現(xiàn)有化療藥物易產(chǎn)生耐藥性并伴有嚴(yán)重不良反應(yīng)，導(dǎo)致癌癥易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)。研究表明，在西藥治療時(shí)介入中藥可明顯增強(qiáng)療效，減輕毒副作用，逆轉(zhuǎn)藥物耐藥[1-2]。同時(shí)，中藥具備多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)，在防治癌癥方面呈現(xiàn)協(xié)同作用優(yōu)勢(shì)，尤其藥食同源的中藥成為抗腫瘤新藥研發(fā)的熱點(diǎn)[3]。

疏花薔薇(RosalaxaRetz.)為薔薇科(Rosaceae)灌木，廣泛分布于新疆海拔500～1 200 m的平原荒漠、戈壁荒地、干溝或河谷旁，抗逆性強(qiáng)，資源豐富[4]。疏花薔薇果為疏花薔薇的干燥果實(shí)，屬藥食同源，富含黃酮、三萜酸、維生素C、多糖、氨基酸等多種化學(xué)成分[5-6]。疏花薔薇果收載于WS3-BW-0103-98《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)》(維吾爾藥分冊(cè))和《哈薩克藥志》，具有固精止瀉、消腫療瘡、益腎明目、通經(jīng)止痛等功效[7]。研究發(fā)現(xiàn)，疏花薔薇果具有抑菌[8]、抗氧化[9]、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[10]等作用。目前，尚未見(jiàn)關(guān)于疏花薔薇果抗腫瘤作用研究的報(bào)道，基于此，作者采用CCK-8法研究新疆疏花薔薇果30%乙醇部位(E1)、50%乙醇部位(E2)、70%乙醇部位(E3)、90%乙醇部位(E4)、水部位(E5)對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803、人食管癌細(xì)胞Eca-109、人肺癌細(xì)胞NCI-H1299及A549、小鼠腹水瘤細(xì)胞S180、人慢性髓原白血病細(xì)胞K562、人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞U937和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7體外增殖的抑制作用，為疏花薔薇果開(kāi)發(fā)為天然抗腫瘤藥物提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

疏花薔薇果，購(gòu)自新疆和田地區(qū)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)徐海燕教授鑒定為疏花薔薇(RosalaxaRetz.)的干燥果實(shí)。人胃癌細(xì)胞MGC-803、人食管癌細(xì)胞Eca-109、人肺癌細(xì)胞NCI-H1299及A549、小鼠腹水瘤細(xì)胞S180、人慢性髓原白血病細(xì)胞K562、人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞U937、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，由中科院細(xì)胞庫(kù)提供。

0.25%胰蛋白酶(批號(hào)25200-056)、胎牛血清(FBS，批號(hào)42H9852K)，美國(guó)Gibco公司；磷酸鹽緩沖液(PBS，批號(hào)0120S22-584-01)，北京希諾因子科技有限公司；RPMI 1640完全培養(yǎng)基(批號(hào)AG29637393)、DMEM高糖培養(yǎng)基(批號(hào)AG29714104)、青霉素-鏈霉素溶液(批號(hào)SV30010)，美國(guó)HyClone公司；細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒(批號(hào)BB01171010)，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜(DMSO)，北京索萊博科技有限公司；5-氟尿嘧啶(純度98%，批號(hào)N20N11W131790)，上海源葉生物科技有限公司；AB-8樹(shù)脂，滄州寶恩吸附材料有限公司；無(wú)水乙醇；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

Galaxy 170R型二氧化碳培養(yǎng)箱，德國(guó)Eppendorf公司；潔凈工作臺(tái)、Multiskan GO型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司；SSW-420-2S型電熱恒溫水槽，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；Motic AE31型倒置顯微鏡；3-18K型離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；AB135-S型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 不同極性部位的提取

稱(chēng)取干燥疏花薔薇果5.0 kg，粉碎過(guò)10目篩，即得疏花薔薇果粗粉；按料液比1∶18(g∶mL,下同)用65%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮后干燥，即得粗浸膏；取粗浸膏適量，加蒸餾水配制成每毫升含1 g原藥材的溶液，并按原藥材與樹(shù)脂質(zhì)量比1∶2上樣，依次用30%、50%、70%、90%乙醇洗脫，分別收集洗脫液，濃縮后冷凍干燥，分別得到30%乙醇部位(E1)、50%乙醇部位(E2)、70%乙醇部位(E3)和90%乙醇部位(E4)。粗提后藥渣按料液比1∶10用蒸餾水煎煮提取2次，每次1 h，合并提取液，濃縮后冷凍干燥，得到水部位(E5)。

1.2.2 供試品的制備

分別精密稱(chēng)取上述疏花薔薇果不同極性部位100 mg，用DMSO配制成質(zhì)量濃度為200 mg·mL-1的溶液，給藥前采用相應(yīng)的培養(yǎng)基配制成質(zhì)量濃度為2 000 μg·mL-1的母液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，分裝，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫R用前現(xiàn)配。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞復(fù)蘇后分別接種于裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，其中MGC-803、Eca-109、NCI-H1299、A549、S180、K562和U937細(xì)胞接種于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，MCF-7細(xì)胞接種于DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，及時(shí)傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 不同極性部位體外抗腫瘤活性的測(cè)定

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC-803、Eca-109、NCI-H1299、A549、S180、K562、U937、MCF-7細(xì)胞，用PBS清洗2次后，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化2～3 min，然后加入1～2 mL RPMI 1640完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，再加入1 mL RPMI 1640完全培養(yǎng)基吹打均勻，制成單細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞終濃度為8×103～10×103個(gè)·mL-1，接種至96孔板中，每孔接種100 μL細(xì)胞懸液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，加入100 μL不同濃度的含藥培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度(μg·mL-1)分別為1 000、300、100、30、10、3 的疏花薔薇果不同極性部位溶液；陽(yáng)性對(duì)照組加入終濃度(μg·mL-1)分別為100、30、10、3、1、0.3的5-氟尿嘧啶(5-Fu)溶液；空白對(duì)照組僅加入相同體積的培養(yǎng)基。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，棄上清液，避光加入100 μL 10%CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度(OD)。按式(1)計(jì)算樣品對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率，并運(yùn)用SPSS軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)，以IC50值作為評(píng)價(jià)疏花薔薇果不同極性部位對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的毒性指標(biāo)。

(1)

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

2 結(jié)果與討論

2.1 疏花薔薇果不同極性部位對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)的影響

在倒置顯微鏡下觀察，與空白對(duì)照組相比，給予不同濃度的疏花薔薇果不同極性部位后，低濃度條件下出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞增殖速度變慢，細(xì)胞變圓、漲大的現(xiàn)象；高濃度條件下出現(xiàn)細(xì)胞皺縮破裂，細(xì)胞間隙明顯增大，細(xì)胞碎片增多，細(xì)胞呈沙粒狀空泡的現(xiàn)象，在1 000 μg·mL-1、300 μg·mL-1、100 μg·mL-1濃度條件下，大部分腫瘤細(xì)胞均無(wú)法維持完整的細(xì)胞形態(tài)。

2.2 疏花薔薇果不同極性部位對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

疏花薔薇果不同極性部位對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率見(jiàn)表1，對(duì)腫瘤細(xì)胞的IC50值見(jiàn)表2。

表1 疏花薔薇果不同極性部位對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率Tab.1 Inhibition rate of tumor cells by different polar extracts of Rosa laxa

續(xù)表1

表2 疏花薔薇果不同極性部位對(duì)腫瘤細(xì)胞的IC50值Tab.2 IC50 values of different polar extracts of Rosa laxa Retz.fruits to tumor

由表1、表2可知，與空白對(duì)照組相比，給予疏花薔薇果不同極性部位E1、E2、E3、E4、E5作用72 h后，各腫瘤細(xì)胞的增殖均受到不同程度的抑制，并呈濃度依賴(lài)性。其中，E1對(duì)各腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用最明顯，IC50值為(19.63±0.36)～(206.60±3.38) μg·mL-1；E1、E2對(duì)MGC-803細(xì)胞的增殖均有明顯抑制作用，IC50值分別為(19.63±0.36) μg·mL-1、(47.24±0.49) μg·mL-1；E3對(duì)S180、U937細(xì)胞具有一定的抑制作用，IC50值分別為(73.18±8.31) μg·mL-1、(69.06±1.14) μg·mL-1；E4對(duì)Eca-109、NCI-H1299、S180細(xì)胞的增殖有較弱的抑制作用，IC50值分別為(58.06±3.63) μg·mL-1、(79.31±5.93) μg·mL-1、(75.71±5.77) μg·mL-1；E5可明顯抑制K562、S180細(xì)胞的增殖，IC50值分別為(30.04±2.68) μg·mL-1、(42.38±5.97) μg·mL-1。

2.3 討論

薔薇屬植物富含的多糖、類(lèi)胡蘿卜素、類(lèi)黃酮和酚酸等活性成分與抗腫瘤活性具有潛在聯(lián)系。肖輝等[11]研究發(fā)現(xiàn)，野薔薇果的乙醇提取物可誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、人乳腺癌細(xì)胞(Bcap-37)、人卵巢癌細(xì)胞(HO8910)和人膀胱癌細(xì)胞(T24)的早期凋亡，并可抑制小鼠S180實(shí)體瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)腹水瘤小鼠的生存時(shí)間。黃俞龍等[12-13]研究發(fā)現(xiàn)，從金櫻子提取物中分離獲得的黃酮類(lèi)成分槲皮素、蘆丁及多糖類(lèi)成分，能有效抑制人肝癌細(xì)胞(BEL-7402)的增殖，且對(duì)正常肝細(xì)胞(HL-7702)的毒性較低。Fujii等[14]研究發(fā)現(xiàn)，犬薔薇的甲醇提取物中含有的原花青素可以防止豚鼠皮膚和小鼠黑色素瘤細(xì)胞中黑色素的生成。Ayati等[15]研究發(fā)現(xiàn)，犬薔薇提取物可抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2、HT-29)、MCF-7細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞(HepG2)的生長(zhǎng)，并且在正常肝細(xì)胞原代培養(yǎng)中無(wú)毒性。

疏花薔薇果中主要含有黃酮、多酚、多糖等化學(xué)成分，已有研究表明，植物中含有的黃酮、多酚成分具有一定的抗腫瘤作用，能抑制胃癌細(xì)胞增殖[16]，多糖類(lèi)成分能促進(jìn)K562細(xì)胞凋亡[17]、抑制動(dòng)物S180實(shí)體瘤的生長(zhǎng)[18]。本研究采用CCK-8法初步考察了疏花薔薇果不同極性部位的體外抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)不同極性部位對(duì)8種腫瘤細(xì)胞的增殖均有不同程度的抑制作用，抑制率與提取物濃度呈明顯的量效關(guān)系。其中，E1對(duì)各腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用強(qiáng)于其它極性部位，對(duì)MGC-803細(xì)胞的抑制作用尤為顯著，IC50值為(19.63±0.36) μg·mL-1，表明疏花薔薇果30%乙醇部位富集了較多抗腫瘤活性成分；E5對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制作用顯著，IC50值為(30.04±2.68) μg·mL-1，對(duì)S180細(xì)胞也具有較好的抑制作用，IC50值為(42.38±5.97) μg·mL-1，可能與水部位中含有多糖等極性較大的化學(xué)成分有關(guān)；除E2對(duì)S180細(xì)胞增殖的抑制作用較弱外，其余極性部位對(duì)該細(xì)胞均有一定的抑制作用，這與其同屬植物野薔薇果的抗腫瘤活性部位相一致。

3 結(jié)論

采用CCK-8法研究了新疆疏花薔薇果30%乙醇部位(E1)、50%乙醇部位(E2)、70%乙醇部位(E3)、90%乙醇部位(E4)、水部位(E5)對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803、人食管癌細(xì)胞Eca-109、人肺癌細(xì)胞NCI-H1299及A549、小鼠腹水瘤細(xì)胞S180、人慢性髓原白血病細(xì)胞K562、人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞U937和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7體外增殖的抑制作用。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，疏花薔薇果不同極性部位對(duì)各腫瘤細(xì)胞的體外增殖均具有不同程度的抑制作用，其中E1對(duì)各腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用最明顯，對(duì)MGC-803細(xì)胞的抑制作用尤為顯著，IC50值為(19.63±0.36) μg·mL-1；E3對(duì)U937細(xì)胞的增殖有一定抑制作用，IC50值為(69.06±1.14) μg·mL-1；E4對(duì)Eca-109細(xì)胞的增殖有一定抑制作用，IC50值為(58.06±3.63) μg·mL-1；E5對(duì)K562細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，IC50值為(30.04±2.68) μg·mL-1。疏花薔薇果具有開(kāi)發(fā)為天然抗腫瘤藥物的潛在價(jià)值，疏花薔薇果發(fā)揮抗腫瘤作用藥效成分的分離、純化及其作用機(jī)制有待后續(xù)進(jìn)一步研究。