李敏琦，譚思遠，唐藝金，唐毅，2，鄭昭芬，2

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一種以肺血管重塑和肺動脈壓力升高為特征的致命性疾病，可導致右心室肥厚、纖維化，最終發(fā)展成右心衰竭甚至導致患者死亡［1］。盡管經過了有效的管理與治療，PAH患者仍存在癥狀反復發(fā)作、預后欠佳等情況。因此，尋找新型的、能有效治療PAH的藥物具有重要意義。

研究表明，內皮素1通路、前列環(huán)素通路和一氧化氮（nitric oxide，NO）/可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（soluble guanylate cyclase，sGC）/環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）通路在PAH發(fā)生發(fā)展過程中具有重要意義［2］，其中，增加cGMP水平的治療策略是目前已批準的治療方案之一［3-4］。沙庫巴曲纈沙坦是一種由腦啡肽酶抑制劑和1型血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑組成的復合藥物，其能通過調控cGMP水平及抑制利鈉肽的降解而發(fā)揮舒張血管、抗心肌肥厚及纖維化的作用［5-6］。近年來，國外有少量研究表明，沙庫巴曲纈沙坦可通過增加體內cGMP水平而舒張小動脈并改善血管重塑，有作為PAH有效治療方式的潛力［4，6］，但國內尚未見相關報道。本研究旨在探討沙庫巴曲纈沙坦治療PAH大鼠的效果及其機制，以期為臨床PAH的藥物治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2020年6—11月。

1.2 實驗大鼠 27只6周齡雄性SD大鼠（體質量160～180 g）購自湖南斯萊克景達實驗動物公司，飼養(yǎng)在室內空氣（O2濃度為21%）、光照/黑暗12 h交替循環(huán)的環(huán)境中，使用專用大鼠合成飼料喂養(yǎng)，不限制飲水。本實驗經湖南省人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（批準文號：2020-59）。

1.3 主要實驗試劑 野百合堿（monocrotaline，MCT）購自美國Sigma-Aldrich公司，抗α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）抗體購自美國Abcam公司，cGMP ELISA試劑盒購自美國開曼公司，心房利鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP）ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組與干預方法 適應性喂養(yǎng)1周后將大鼠隨機分為對照組、PAH組和沙庫巴曲纈沙坦組，各9只。將MCT溶解在1 mol/L的HCl溶液中，并用1 mol/L的NaOH溶液調節(jié)pH值至7.4，以制備MCT溶液；PAH組、沙庫巴曲纈沙坦組大鼠單次腹腔注射MCT溶液（60 mg/kg）以構建PAH模型，對照組大鼠單次腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液；從第2天起，對照組、PAH組給予0.5%羥乙基纖維素鈉灌胃（3 ml·kg-1·d-1），沙庫巴曲纈沙坦組給予沙庫巴曲纈沙坦灌胃（將100 mg沙庫巴曲纈沙坦溶于5 ml 0.5%羥乙基纖維素鈉中）（60 mg·kg-1·d-1），持續(xù)給藥3周。PAH組中1只大鼠在實驗第18天死亡。

1.4.2 血流動力學、右心室重構指標檢測 實驗結束后腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）以麻醉大鼠，分離頸部血管，將聚乙烯-50導管經右頸外靜脈送入右心室，使用生物信號采集和分析系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）測量并記錄大鼠右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP），共測量3次，取平均值。檢測完RVSP后，對所有大鼠進行安樂死，打開大鼠胸腔，立即解剖心臟和肺，將右心室從左心室和室間隔中分離出來，并分別稱重，計算右心室肥厚指數（right ventricular hypertrophy，RVH），RVH=右心室重量/（左心室重量+室間隔重量）。

1.4.3 肺血管重構指標檢測 使用4 ℃的杜氏磷酸鹽緩沖液灌洗大鼠肺后取出肺組織，并用4%多聚甲醛溶液固定，乙醇溶液脫水、石蠟包埋并切片后進行HE染色；收集肺小動脈（直徑為30～100 μm）的圖像并測量其外徑和肺動脈中膜厚度（pulmonary artery media thickness，PAMT），計算肺動脈中膜厚度百分比（percentage of pulmonary artery media thickness，PAMT%），PAMT%=2×PAMT/外徑×100%。大鼠肺組織經固定切片后進行抗α-SMA免疫組化染色，使用Image-Pro Plus 6.0版軟件（美國Media Cybernetics公司）計算α-SMA積分光密度值，即α-SMA水平。

1.4.4 血漿cGMP、ANP檢測 檢測完RVSP后，從大鼠的腹主動脈收集全血樣本，1 000 r/min離心10 min（離心半徑8.6 cm），取血漿保存在-80 ℃冰箱中備用。參照ELISA試劑盒說明書檢測各組大鼠血漿cGMP、ANP。

1.5 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血流動力學、右心室重構指標 三組大鼠RVSP、RVH比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；PAH組、沙庫巴曲纈沙坦組大鼠RVSP、RVH高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；沙庫巴曲纈沙坦組大鼠RVSP、RVH低于PAH組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 三組大鼠血流動力學、右心室重構指標比較（±s）Table 1 Comparison of hemodynamic and right ventricular remodeling indexes in the three groups

表1 三組大鼠血流動力學、右心室重構指標比較（±s）Table 1 Comparison of hemodynamic and right ventricular remodeling indexes in the three groups

注：PAH=肺動脈高壓，RVSP=右心室收縮壓，RVH=右心室肥厚指數；1 mm Hg=0.133 kPa；a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與PAH組比較，P＜0.05

組別 只數 RVSP（mm Hg） RVH對照組 9 28.6±6.6 0.23±0.02 PAH組 8 56.6±10.4a 0.44±0.09a沙庫巴曲纈沙坦組 9 40.6±8.4ab 0.34±0.05ab F值 22.967 28.470 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.2 肺血管重構指標 三組大鼠PAMT%、α-SMA比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；PAH組、沙庫巴曲纈沙坦組大鼠PAMT%、α-SMA高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；沙庫巴曲纈沙坦組大鼠PAMT%、α-SMA低于PAH組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2、圖1～2。

圖1 三組大鼠肺組織HE染色結果（×20）Figure 1 HE staining results of lung tissue of rats in three groups

圖2 三組大鼠肺組織α-SMA免疫組化染色結果（×20）Figure 2 Immunohistochemical staining results of α-SMA in lung tissue of rats in three groups

表2 三組大鼠肺血管重構指標比較（±s）Table 2 Comparison of pulmonary vascular remodeling indexes in the three groups

注：PAMT%=肺動脈中膜厚度百分比，α-SMA=α-平滑肌肌動蛋白；a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與PAH組比較，P＜0.05

組別 只數 PAMT%（%） α-SMA（AU）對照組 9 18.6±2.0 1.19±0.12 PAH組 8 43.7±1.9a 1.62±0.18a沙庫巴曲纈沙坦組 9 29.0±2.1ab 1.40±0.07ab F值 340.096 24.472 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 血漿cGMP、ANP 三組大鼠血漿cGMP、ANP比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；PAH組大鼠血漿cGMP低于對照組，血漿ANP高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；沙庫巴曲纈沙坦組大鼠血漿cGMP、ANP高于對照組、PAH組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 三組大鼠血漿cGMP、ANP比較（±s）Table 3 Comparison of plasma cGMP and ANP in the three groups

表3 三組大鼠血漿cGMP、ANP比較（±s）Table 3 Comparison of plasma cGMP and ANP in the three groups

注：cGMP=環(huán)磷酸鳥苷，ANP=心房利鈉肽；a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與PAH組比較，P＜0.05

組別 只數 cGMP（pmol/ml） ANP（pg/ml）對照組 9 0.20±0.04 214.4±79.7 PAH組 8 0.14±0.21a 313.8±110.6a沙庫巴曲纈沙坦組 9 0.35±0.09ab 521.3±111.3ab F值 28.191 21.501 P值 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

PAH是嚴重影響人類健康的疾病，其突出特點是肺血管重塑導致肺血管阻力和肺動脈壓升高。在PAH發(fā)生發(fā)展過程中，肺循環(huán)后負荷持續(xù)升高可導致右心室肥大、右心室纖維化和右心室功能障礙，最終導致右心衰竭。沙庫巴曲纈沙坦是腦啡肽酶抑制劑和血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑組成的復合藥物，可發(fā)揮舒張血管、抗心室重構的作用。本研究旨在進一步探討沙庫巴曲纈沙坦對PAH大鼠右心室肥厚、肺血管重構的影響及其潛在機制。

本研究結果顯示，PAH組、沙庫巴曲纈沙坦組大鼠RVSP高于對照組，提示造模成功；沙庫巴曲纈沙坦組大鼠RVSP低于PAH組，提示沙庫巴曲纈沙坦可減小PAH大鼠右心室壓力。本研究結果還顯示，PAH組、沙庫巴曲纈沙坦組大鼠RVH高于對照組，沙庫巴曲纈沙坦組大鼠RVH低于PAH組，表明沙庫巴曲纈沙坦可以減輕PAH大鼠右心室重構。此外，本研究結果還顯示，PAH組、沙庫巴曲纈沙坦組大鼠PAMT%、α-SMA高于對照組，沙庫巴曲纈沙坦組大鼠PAMT%、α-SMA低于PAH組，提示沙庫巴曲纈沙坦可以減輕PAH大鼠肺血管重構。ANDERSEN等［6］通過Mikro-Tip導管測量SU5416和缺氧（SU5416 and hypoxia，SuHx）誘導的PAH大鼠的RVSP，并采用體視學方法評估肺血管和右心室組織形態(tài)學改變情況，結果顯示，沙庫巴曲纈沙坦能夠降低大鼠RVSP，減輕大鼠肺血管重構及右心室肥厚、擴張，本研究結果與之相似。

舒張血管以降低血管阻力是PAH的重要治療策略，而cGMP、ANP在血管舒張過程中發(fā)揮著重要作用。組織中的NO可激活sGC，而激活后的sGC可促進其底物三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）轉化為cGMP并激活蛋白激酶G（protein kinases G，PKG），進而導致平滑肌松弛［7-8］。有研究提示，ANP延緩PAH進展的潛在機制可能是其與自身受體結合后，可使cGMP水平升高，進而促進血管舒張［9］。CLEMENTS等［10］研究顯示，沙庫巴曲纈沙坦能降低SuHx誘導的PAH大鼠的右心室舒張末期壓和肺動脈收縮壓，減輕右心室肥厚及纖維化，減輕肺血管重構，增加肺組織中ANP、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）、cGMP水平。本研究結果顯示，PAH組大鼠血漿cGMP水平低于對照組，沙庫巴曲纈沙坦組大鼠血漿cGMP水平高于對照組、PAH組，提示沙庫巴曲纈沙坦可能通過升高血漿cGMP水平來降低PAH大鼠RVSP、減輕其右心室重構及肺血管重構。本研究結果還顯示，PAH組大鼠血漿ANP水平高于對照組，這可能與PAH發(fā)病時右心負荷增加導致心肌細胞釋放ANP有關；沙庫巴曲纈沙坦組大鼠血漿ANP水平高于對照組、PAH組，分析原因為沙庫巴曲纈沙坦可抑制腦啡肽酶，從而減少ANP的降解。

綜上所述，沙庫巴曲纈沙坦可以降低PAH大鼠RVSP，減輕大鼠右心室重構和肺血管重構，其機制可能與上調大鼠血漿cGMP水平有關，這為PAH的臨床治療提供了新思路。但本研究是通過MCT構建PAH大鼠模型的，結果不宜直接套用到其他PAH模型（如SuHx誘導的PAH模型）上，需要在不同方法構建的PAH模型中進一步驗證沙庫巴曲纈沙坦治療PAH的效果。

作者貢獻：李敏琦進行文章的構思與設計，撰寫論文；李敏琦、唐毅進行研究的可行性分析、論文修訂；李敏琦、譚思遠、唐藝金進行實驗實施及統(tǒng)計學處理；鄭昭芬負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。