張 敏，楊 華，魏巧蘭，何高明，沈 敏*

(1．石河子大學 動物科技學院，新疆 石河子 832000;2．新疆農(nóng)墾科學院，新疆 石河子 832000)

羊毛是紡織業(yè)重要的原料，羊毛品質(zhì)決定著羊毛的價格和紡紗性能。其中羊毛的纖維直徑是決定羊毛品質(zhì)的關鍵因素。毛囊是羊毛生長發(fā)育的基礎，研究毛囊發(fā)育對羊毛品質(zhì)形成的遺傳學機理具有重要意義。研究表明，羊毛纖維直徑的大小受毛囊發(fā)育的影響[1]。毛干在皮膚經(jīng)歷周期性生長和脫落，而底部毛囊也經(jīng)歷包括生長期、退行期、休止期3個時期周期性循環(huán)。其中，生長期是毛干發(fā)生的時間，在此期間毛乳頭細胞增殖，毛球膨大，毛母質(zhì)細胞分化，毛囊向下生長至真皮層。毛囊生長期決定了羊毛的長度和細度，是研究毛囊發(fā)育信號分子調(diào)控的關鍵階段。退行期的毛乳頭毛球部萎縮，導致毛發(fā)逐步停止生長。而休止期毛囊上皮細胞變少，毛發(fā)脫落。隨后在基因調(diào)控下再一次進入生長期。毛囊周期發(fā)育受多種信號通路和相關基因調(diào)控，影響毛囊發(fā)育的通路包括WNT通路、EDAR通路、BMP通路、FGF通路和SHH通路[1-5]，毛囊發(fā)育相關基因包括Wnt10b[6]、Edar[7]、BMP4[8]、FGF5[9]、PTCH1[10]等基因。其中，F(xiàn)GF5是FGF信號通路中已知的最有效的促進毛囊從生長期到休止期轉(zhuǎn)換的因子，對毛囊發(fā)育調(diào)控至關重要[9]。Higgins等研究證實，F(xiàn)GF5能夠誘導人毛囊的退行期，是決定人毛囊生長期比例和毛發(fā)生長的關鍵調(diào)節(jié)因子[11]。He等[12]通過在體外培養(yǎng)的絨山羊真皮乳頭細胞中過表達FGF5，發(fā)現(xiàn)FGF5能夠顯著下調(diào)維持毛囊生長重要因子IGF-1、versican和noggin的表達。另外，Yoshizawa等[13]研究證實，F(xiàn)GF5基因突變可導致敘利亞倉鼠中毛發(fā)長度變長，這證明了FGF5可以調(diào)控毛囊發(fā)育。EEF1D是翻譯延伸因子復合物的亞基，在細胞中負責蛋白質(zhì)翻譯的過程。于常江等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在綿羊皮膚成纖維細胞中過表達EEF1D基因可顯著上調(diào)FGF5的表達。由此可見，EEF1D基因參與毛囊發(fā)育調(diào)控。然而， 目前針對EEF1D基因表達與羊毛品質(zhì)以及毛囊發(fā)育的研究較少。因此，本研究以中國美利奴羊和多胎薩?？搜驗檠芯繉ο?，分析EEF1D基因的組織表達差異，以及在品種間和毛囊發(fā)育周期的表達變化，為深入研究EEF1D基因在毛囊周期和羊毛品質(zhì)形成中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗羊選自新疆農(nóng)墾科學院種羊場中同一飼養(yǎng)條件下2～3歲健康成年羊，包括3只中國美利奴羊(新疆軍墾型)和3只多胎薩?？搜?。參照程曉印[15]毛囊發(fā)育周期時間，采集處于毛囊生長期(10月)、退行期(1月)和休止期(4月)綿羊體側(cè)部皮膚組織和羊毛樣品，以及中國美利奴羊(新疆軍墾型)的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、皮膚、肌肉、脂肪、大腦和小腦組織。羊毛樣品標記后用于細度測定，組織樣品立即置于液氮中，轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

1.3 方法

1.3.1 羊毛纖維直徑測定 羊毛樣品洗凈后，使用哈氏切片器(Y172型)制備羊毛纖維橫截面試樣切片，按照GB/T 10685-1989國家標準羊毛纖維直徑試驗方法，采用中國紡織科學研究院北京和眾視野科技有限公司的CU-4纖維細度儀對羊毛切片進行纖維直徑測定，每只羊取400根羊毛進行測定。

1.3.2 引物設計及合成 設計EEF1D基因(GenBank登錄號：XM_015097560.1)和GAPDH基因(GenBank登錄號：XM_001289746.1)的實時熒光定量PCR引物[14]，并交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。引物信息如表1所示。

表1 EEF1D和 GAPDH基因?qū)崟r熒光定量引物信息

1.3.3 組織總RNA提取和cDNA合成 按照Trizol試劑使用說明書提取組織總RNA。按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明進行cDNA第一鏈的合成。20 μL體系和程序如下：5×gDNA Eraser Buffer(2.0 μL)，gDNA Eraser(1.0 μL)，Total RNA(2.0 μL)，RNase Free ddH2O(5.0 μL)在42 ℃孵育2 min，隨后添加PrimeScript RT Enzyme Mix I(1.0 μL)、RT prime Mix(1.0 μL)、5×gDNA Eraser Buffer 2(for Real Time)(4.0 μL)、RNA Free ddH2O(4.0 μL)至PCR管中，37 ℃孵育15 min，85 ℃ 5 s。合成的cDNA 保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4EEF1D和GAPDH基因的PCR擴增EEF1D基因和GAPDH基因的PCR擴增體系均為20 μL，包括2×MasterMix(10 μL)，上、下游引物(各0.5 μL)，cDNA(1 μL)，ddH2O(8 μL)。

qRT-PCR擴增反應程序為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，45個循環(huán)；95 ℃ 5 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s；40 ℃ 30 s。擴增完成后，進行熔解曲線分析，分別讀取EEF1D和GAPDH基因的CT值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法計算EEF1D基因表達，應用IBM SPSS Statistics 22.0軟件的ANOVA模塊分析各組羊毛纖維直徑、基因表達水平的差異。比較在不同組織和品種間以及羊毛不同發(fā)育時期的EEF1D基因表達差異，并進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果和分析

2.1 品種間羊毛纖維直徑分析

統(tǒng)計分析在毛囊生長期、退行期和休止期中國美利奴羊和多胎薩?？搜虻难蛎w維直徑和離散系數(shù)，結(jié)果如表2所示。在品種間，中國美利奴羊羊毛纖維直徑極顯著低于多胎薩福克羊(P<0.01)。

表2 多胎薩福克羊和中國美利奴羊的羊毛纖維直徑的比較

2.2 總RNA提取

經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，綿羊10個組織的總RNA均存在28 s、18 s 和5 s 這3個條帶，且條帶清晰，無明顯拖尾現(xiàn)象。核酸蛋白測定儀檢測OD260/280值均介于1.8～2.0之間。

2.3 EEF1D和GAPDH基因的PCR擴增

將逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA各取1 μL模板進行EEF1D基因和GAPDH基因PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳圖條帶與設計目的條帶大小基本一致。結(jié)果如圖1所示。

圖1 EEF1D(A)和GAPDH(B)基因的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.4 EEF1D基因的組織表達分析

由圖2可見，EEF1D基因在中國美利奴羊(新疆軍墾型)10種組織中均有表達。其中，EEF1D基因在皮膚組織中表達量最高(P<0.05)。

圖2 EEF1D基因的組織表達圖

2.5 EEF1D基因在綿羊品種間和毛囊發(fā)育周期中的表達水平分析

由圖3可知，中國美利奴羊(新疆軍墾型)和多胎薩?？搜騼蓚€品種綿羊皮膚組織中EEF1D基因在毛囊發(fā)育期表達趨勢一致，在休止期表達量最高，在退行期表達量最低(P<0.05)。在毛囊生長期和退行期，中國美利奴羊皮膚組織中EEF1D基因表達量顯著和極顯著高于多胎薩福克羊(P<0.05和P<0.01)。而在休止期，EEF1D基因的表達量在品種間差異不顯著。

圖3 EEF1D基因在綿羊毛囊發(fā)育期和品種間的表達變化

3 討 論

我國是世界上最大的綿羊生產(chǎn)國，也是世界第三大羊毛生產(chǎn)國。但2020年1月-2020年10月，我國羊毛、毛條進口量累計為18.32×104t，羊絨進口量累計為0.59×104t[16]。羊毛市場的供需不平衡，優(yōu)質(zhì)細羊毛很大程度依賴進口，需要進一步提升國內(nèi)毛用羊的羊毛品質(zhì)。細度、長度、彎曲、吸濕性和回潮率等均是影響羊毛品質(zhì)的重要因素，其中羊毛細度的經(jīng)濟價值相當于其他因素價值的總和。在羊毛市場上，超細毛價格是普通羊毛2～3倍。因此，優(yōu)質(zhì)細羊毛是市場關注的重點[17]，也是科研突破的焦點。研究細毛羊的羊毛品質(zhì)形成的遺傳學機理，對提升羊毛品質(zhì)、推動優(yōu)質(zhì)細毛羊的育種進程有重要意義。

中國美利奴羊是在我國新疆育成的重要細毛羊品種，具有優(yōu)秀毛品質(zhì)的種質(zhì)特性。多胎薩福克羊也是在我國新疆育成的多胎肉用羊新品系，以高繁殖力為主、兼具肉用性能好的種質(zhì)特性。本試驗中，中國美利奴羊平均羊毛纖維直徑為16.41 μm，而多胎薩?？似骄蛎w維直徑為29.2 μm，中國美利奴羊的毛纖維直徑顯著低于多胎薩?？搜?。該研究結(jié)果與王晶晶等[18]結(jié)果一致，進一步說明中國美利奴羊具有優(yōu)良的羊毛品質(zhì)。

EEF1D基因在真核生物蛋白質(zhì)合成中負責翻譯延伸過程，發(fā)揮交換因子的作用[24]。在細胞水平，EEF1D基因參與細胞周期活動[20]、卵母細胞成熟、大腦和睪丸轉(zhuǎn)錄激活、調(diào)節(jié)細胞應激反應[21]，以及EF-1βγδ蛋白質(zhì)的合成[22]。在個體水平，EEF1D不但與各種癌癥、神經(jīng)元的發(fā)育[23]、膠質(zhì)瘤[24]有關，且與乳腺發(fā)育和乳脂合成[25]有關。然而，在綿羊毛囊發(fā)育研究方面，EEF1D基因的組織表達以及影響毛囊發(fā)育和羊毛品質(zhì)的研究報道非常少。于常江[14]采集18-30月齡美利奴羊的7個組織樣本，經(jīng)qRT-PCR分析EEF1D基因的組織表達差異，EEF1D基因的表達量從高到低分別：肺臟﹥脾臟﹥皮膚﹥腎臟﹥肝臟﹥心臟﹥肌肉。本試驗中，EEF1D基因在中國美利奴母羊的10個組織中的表達量從高到低依次為：皮膚﹥脂肪﹥脾臟﹥肝臟﹥腎臟﹥小腦﹥肌肉﹥心臟﹥肺臟﹥大腦，與于常江試驗結(jié)果明顯不同。本試驗EEF1D基因在皮膚組織中表達量最高，說明該基因在毛囊發(fā)育中起重要作用。

綿羊的毛囊包括初級毛囊和次級毛囊，初級毛囊在胎兒 65 d開始發(fā)育，次級毛囊在胎兒期85 d開始發(fā)育，次級毛囊的發(fā)育決定羊毛細度和品質(zhì)[26]。綿羊毛囊發(fā)育具有周期性，包括生長期、退行期和休止期。本試驗發(fā)現(xiàn)，毛囊生長期和退行期的中國美利奴羊EEF1D基因表達量顯著高于多胎薩福克羊，即EEF1D基因在粗毛羊皮膚組織中表達量低，在細毛羊皮膚組織中表達量高，說明EEF1D基因的表達與羊毛細度相關。EEF1D基因表達量，在毛囊發(fā)育3個時期差異顯著，且休止期最高，說明EEF1D基因參與毛囊發(fā)育，隨著EEF1D基因表達量升高，使毛囊進入休止期。

4 結(jié) 論

EEF1D基因在皮膚組織中呈高豐度表達。在毛囊生長期和退行期，EEF1D基因在細毛羊中的表達量顯著高于粗毛羊。EEF1D基因的高表達誘導毛囊發(fā)育進入休止期。