牛麗麗

（長治市綜合檢驗檢測中心，山西長治 046000）

黃曲霉毒素俗稱霉菌毒素，是由不同黃曲霉寄生曲霉產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物[1]，由于黃曲霉毒素具有強致癌性，國際癌癥研究機構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）將其列為Ⅰ類致癌物。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)20多種黃曲霉毒素,主要有黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、M1、M26 種。其中，黃曲霉毒素M1（AFT M1）和黃曲霉毒素M2（AFT M2）是黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2在肝微粒體細胞色素P450作用下生成的羥基化代謝物[2]。

本文主要對新修訂的標準GB 5009.24—2016[3]中液相色譜法的系統(tǒng)適應性試驗進行了驗證，確保本檢驗檢測機構(gòu)能夠準確對乳制品中AFT M1和AFT M2進行測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

滅菌乳、發(fā)酵乳、乳粉均購自長治市金威超市；AFT M1和AFT M2溶液標準物質(zhì)，阿杰泰克公司；乙腈、甲醇均為色譜純，美國馬自達公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀（熒光檢測器），島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

樣品提取按照GB 5009.24—2016中12.1進行操作；樣品凈化按照免疫親和柱說明書進行操作。

1.3.2 標準溶液的制備

分別準確吸取AFT M1和AFT M2溶液標準物質(zhì)各1 mL，共置于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得100 ng·mL-1混合標準使用液。分別精密量取上述混合標準使用液 25 μL、50 μL、50 μL、100 μL、500 μL、100 μL、200 μL 和 500 μL，各置于 250 mL、250 mL、100 mL、100 mL、100 mL、10 mL、10 mL 和10 mL容量瓶中，用初始流動相稀釋至刻度，搖勻。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：C18柱；流動相：A相為水，B相為乙腈-甲醇（50+50）；等梯度洗脫條件：A 70%，B 30%；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；波長：激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長430 nm；進樣量：50 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的線性和工作范圍

按1.3.2中的操作進行測定，以AFT M1和 AFT M2的濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線。在0～5 ng·mL-1呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，AFT M1的線性方程為y=3 582 690x+15 840.9，r=0.999 8，AFT M2的線性方程為y=6 777 570x+32 434.1，r=0.999 9，符合 GB/T 27404—2008[4]中驗證方法相關(guān)系數(shù)不應低于0.99的規(guī)定。

2.2 柱容量、柱回收率、交叉反應率驗證

每個批次的免疫親和柱在使用前均需進行質(zhì)量驗證，包括柱容量、柱回收率以及交叉反應率的驗證。按GB 5009.24—2016規(guī)定的操作進行測定，得到同一批次3根免疫親和柱的AFT M1含量（111.3 ng、109.2 ng、111.0 ng）和AFT M2含量（105.6 ng、104.6 ng、105.4 ng）均＞80 ng，說明該免疫親和柱符合同時測定樣品中AFT M1和AFT M2含量的使用要求。

2.3 方法檢出限和定量限

按照GB 5009.24—2016對滅菌乳和乳粉的檢出限和定量限進行測定。由表1可以得到，滅菌乳和乳粉的檢出限信噪比均大于3，定量限的信噪比均大于10，滿足試驗測定要求。

表1 檢出限和定量限的確認

2.4 回收率

從表2中可以看出，樣品中AFT M1添加濃度 在 0.012 5 ～ 0.500 0 μg·kg-1， 平 均 回 收 率 為89%～94%，準確度良好；同時做3水平6平行實驗，RSD為2.8%～7.7%，重復性良好。

表2 AFT M1回收率分析

從表3中可以看出，樣品中AFT M2添加濃度 在 0.006 25 ～ 0.500 00 μg·kg-1， 平 均 回 收 率 為79%～87%，準確度良好；同時做3水平6平行實驗，RSD為1.8%～7.7%，重復性良好?；厥章屎蚏SD均滿足GB/T 27404—2008對驗證試驗的要求。

表3 AFT M2回收率分析

2.5 不同樣品中AFT M1和AFT M2的測定

分別對滅菌乳、發(fā)酵乳、乳粉各3種進行測定，所有樣品中的AFT M1和AFT M2均未檢出（含量均低于方法檢出限）。從側(cè)面說明了乳制品市場的穩(wěn)定性，同時為廣大消費者提供了參考。

3 結(jié)論

不同動物以牛奶中的AFT M1含量最高[5]，同時各種乳制品又是深受廣大消費者喜愛的一類食品，考慮到黃曲霉毒素的強致癌性，GB 2761—2017[6]規(guī)定了乳制品中AFT M1的限量為0.5 μg·kg-1。食品新項目擴項工作要求滿足檢測標準GB/T 27404—2008項下的要求，本文通過對新修訂的標準GB 5009.24—2016中液相色譜法的系統(tǒng)適應性試驗方法進行了驗證，在本檢驗機構(gòu)檢驗條件下，測得該方法具有良好的準確度、精密度和重復性。在0～5 ng·mL-1AFT M1和AFT M2均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。柱驗證試驗證明該免疫親和柱符合同時測定樣品中AFT M1和AFT M2含量的使用要求。方法檢出限、定量限、回收率的研究也表明實驗室滿足定量檢測AFT M1和AFT M2含量的要求。通過對9個乳制品進行測定發(fā)現(xiàn)，樣品均未受到AFT M1和AFT M2的污染。