曾建業(yè)，陳丹丹，王俁棋，呂純莉，王小敏

(遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563000)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)是引起醫(yī)院感染和社區(qū)獲得性感染常見病原體之一，主要引起皮膚軟組織感染、心內(nèi)膜炎、骨髓炎、菌血癥和致死性肺炎等多種疾病[1-2]。SA通?？梢詿o癥狀定植于30%～50%人群的前鼻孔，且SA鼻腔攜帶者的感染風(fēng)險(xiǎn)是非攜帶者的2～12倍[3]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(VRSA)等耐藥菌株在全球范圍內(nèi)出現(xiàn)，是導(dǎo)致患者病死率增加的主要原因，同時(shí)加重了社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4-5]。由于SA對(duì)大多數(shù)常用抗菌藥物耐藥，給醫(yī)療機(jī)構(gòu)帶來了巨大負(fù)擔(dān)，因此，世界衛(wèi)生組織將SA列為優(yōu)先級(jí)Ⅱ類病原體[6]。人體大約80%的慢性和復(fù)發(fā)性感染由細(xì)菌生物被膜引起[3]，SA是生物被膜感染常見的病原體之一[7]。文獻(xiàn)[8]報(bào)道，43%～88%的SA臨床分離株可以形成生物被膜。細(xì)菌生物被膜具有很強(qiáng)抗藥性，能夠幫助細(xì)菌逃避抗菌藥物的殺傷，也是SA產(chǎn)生耐藥性的重要原因[9]。研究[10]表明，86.7%產(chǎn)生生物被膜的SA具有多重耐藥性。因此，SA生物被膜相關(guān)感染是全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域的主要關(guān)注點(diǎn)之一。生物被膜導(dǎo)致治療困難是當(dāng)前面臨的難題，其耐藥機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。目前，尚無有效的針對(duì)生物被膜的治療方法[11]。本文就SA生物被膜耐藥機(jī)制研究的最新進(jìn)展作一綜述，旨在為開發(fā)針對(duì)SA生物被膜新的治療方法提供思路，為生物被膜耐藥相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

1 SA生物被膜概述

細(xì)菌生物被膜是附著在生物和非生物表面的微生物種群組成的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)，表面包裹有細(xì)菌分泌的聚合物如胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)、細(xì)胞外DNA(extracellular DNA, eDNA)、蛋白質(zhì)等細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)成分[12]。影響SA生物被膜耐藥性的相關(guān)因素較多，包括生物被膜基質(zhì)成分與抗菌藥物的相互作用，生物被膜的異質(zhì)性，持久細(xì)胞(persister cells)的出現(xiàn)，外排泵(efflux pump，EP)的表達(dá)增加，抗菌藥物抗性基因的種間轉(zhuǎn)移等。

2 SA生物被膜耐藥性產(chǎn)生機(jī)制

2.1 eDNA增強(qiáng)細(xì)菌耐藥性 eDNA是SA生物被膜基質(zhì)的主要成分，不僅可以增加生物被膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，還可以增加對(duì)帶正電荷抗菌藥物(電荷的正負(fù)受微環(huán)境pH影響)的耐藥性[13-14]。SA在生物被膜成熟期間發(fā)生裂解并釋放基因組DNA，是eDNA形成的主要原因，但具體形成機(jī)制未完全闡明[13,15]。SA一般通過自溶素A介導(dǎo)的自溶(裂解的一種方式)釋放eDNA，但低抑制劑量的抗菌藥物通過殺死一小部分細(xì)菌也可以刺激eDNA的釋放[16]。eDNA作為陰離子可螯合和中和陽(yáng)離子殺菌分子，包括氨基糖苷類、青霉素G等抗菌藥物和防御素、乳鐵蛋白等抗菌肽，并限制陽(yáng)離子抗菌劑的擴(kuò)散[17]。帶負(fù)電荷的eDNA可以通過降低電化學(xué)梯度降低對(duì)氨基糖苷類藥物、四環(huán)素類藥物和大環(huán)內(nèi)酯類藥物的敏感性[18]。如萬古霉素和eDNA的結(jié)合常數(shù)比萬古霉素和其靶標(biāo)肽聚糖前體中D-Ala-D-Ala肽的結(jié)合常數(shù)高100倍，導(dǎo)致萬古霉素消耗在生物被膜ECM中[18]。此外，eDNA能夠酸化局部環(huán)境，促進(jìn)抗菌藥物耐藥表型的產(chǎn)生[19]。eDNA還參與基因水平轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer，HGT)，即基因組之間遺傳信息的非接合性轉(zhuǎn)移[15]。因此，eDNA可以作為有價(jià)值的抗生物被膜靶標(biāo)。

2.2 持久細(xì)胞對(duì)抗菌藥物的耐受作用 持久細(xì)胞與SA生物被膜的抗菌藥物耐受性有關(guān)，是生物被膜相關(guān)復(fù)發(fā)性感染的主要原因[20]。持久細(xì)胞是一種短暫耐抗菌藥物的細(xì)菌細(xì)胞，通常生長(zhǎng)緩慢或生長(zhǎng)受阻[21]。在生物被膜相關(guān)感染中，抗菌藥物可以清除生物被膜內(nèi)的大部分細(xì)菌，包括從生物被膜中脫離的細(xì)菌，其余的可以被免疫系統(tǒng)清除，但是留在內(nèi)部或基部的持久細(xì)胞很難被抗菌藥物清除[22]。SA持久細(xì)胞內(nèi)電子傳遞鏈的缺陷導(dǎo)致色素沉著，細(xì)胞壁合成、生長(zhǎng)、呼吸等過程的減少和外毒素的產(chǎn)生，進(jìn)而降低通過靶向這些細(xì)胞過程發(fā)揮殺菌活性的抗菌藥物(如β-內(nèi)酰胺類藥物)的功效，使持久細(xì)胞對(duì)抗菌藥物具有耐受性[23]。SA生物被膜內(nèi)的高細(xì)胞密度環(huán)境，氧氣、營(yíng)養(yǎng)的缺乏和細(xì)胞內(nèi)ATP濃度降低，SOS反應(yīng)的啟動(dòng)和毒素-抗毒素(toxin-antitoxin, TA)系統(tǒng)基因的表達(dá)等均能促進(jìn)持久細(xì)胞的產(chǎn)生[24]。TA系統(tǒng)是持久細(xì)胞產(chǎn)生的主要因素，而ATP濃度下降似乎是SA持久細(xì)胞在抗菌藥物作用下存活的主要因素[20]。長(zhǎng)期抗菌治療促進(jìn)持久細(xì)胞產(chǎn)生，導(dǎo)致慢性感染反復(fù)出現(xiàn)[22]?？咕委煂?duì)持久細(xì)胞的“致命弱點(diǎn)”，是重新激活與生物被膜相關(guān)的慢性感染的關(guān)鍵因素，一旦撤銷抗菌藥物，充當(dāng)疾病儲(chǔ)存庫(kù)的持久細(xì)胞就可以重新激活、分裂繁殖并出現(xiàn)感染[22,25]。因此，清除持久細(xì)胞可能是消滅生物被膜相關(guān)慢性和復(fù)發(fā)性感染的關(guān)鍵步驟。

2.3 HGT介導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性 HGT允許抗性基因轉(zhuǎn)移到其他種類的細(xì)菌內(nèi)，是已知的新抗性基因傳播的主要機(jī)制，促進(jìn)細(xì)菌耐藥性的快速傳播[26]。耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移是生物被膜內(nèi)的細(xì)菌對(duì)抗菌藥物耐藥的重要作用機(jī)制之一。生物被膜內(nèi)穩(wěn)定的物理環(huán)境、高細(xì)胞密度、增強(qiáng)的遺傳能力和積累的可移動(dòng)遺傳元件，為有效的HGT(包括對(duì)耐藥基因的攝取)提供了理想的環(huán)境[27]。細(xì)菌可以通過接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)和自然轉(zhuǎn)化來獲取和整合新的基因[28]。大多數(shù)SA可被噬菌體溶源化，噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)是SA中常見的HGT機(jī)制[29]。整合子是由整合酶基因、特異性重組位點(diǎn)和啟動(dòng)子組成的遺傳元件。通過整合子調(diào)節(jié)抗生素抗性基因是生物被膜通過HGT增強(qiáng)獲得抗微生物抗性的決定因素[30]。研究[25]表明，SA生物被膜可通過接合或非接合性質(zhì)粒的傳遞導(dǎo)致質(zhì)粒攜帶的抗生素抗性基因傳播。SA在生物被膜狀態(tài)下的多藥抗性質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移頻率比浮游狀態(tài)高10 000倍，這可能是由于生物被膜內(nèi)的細(xì)菌位置相對(duì)固定和鄰近[31]。生物被膜中細(xì)胞與細(xì)胞的緊密接觸為HGT創(chuàng)造了有利條件，生物被膜的形成增加SA通過HGT獲得和傳播攜帶耐藥基因質(zhì)粒的能力[32]。因此，為預(yù)防和控制生物被膜內(nèi)SA通過抗性基因的水平轉(zhuǎn)移增強(qiáng)耐藥性，需要探索新的治療靶點(diǎn)或組合療法。

2.4 群體感應(yīng)(quorum sensing, QS)增強(qiáng)細(xì)菌耐藥性 QS是細(xì)菌細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)的過程，依賴于被稱為自誘導(dǎo)劑的細(xì)胞外信號(hào)分子的產(chǎn)生、檢測(cè)和響應(yīng)[33]。細(xì)菌QS信號(hào)主要由酰基高絲氨酸內(nèi)酯(acyl-homoserine lactone, AHL)、自體誘導(dǎo)肽(autoinducing peptide, AIP)和自體誘導(dǎo)物Ⅱ類分子(autoinducer-2, AI-2)組成，參與細(xì)菌的各種生理過程，包括生物被膜形成，質(zhì)粒接合、運(yùn)動(dòng)和抗菌藥物抵抗[34]。一方面，QS系統(tǒng)能夠調(diào)節(jié)生物被膜形成基因，也能調(diào)節(jié)細(xì)菌耐藥相關(guān)基因[35]。細(xì)菌可以通過QS系統(tǒng)調(diào)節(jié)，從單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎鄠€(gè)細(xì)胞協(xié)同的方式生存，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)樯锉荒どL(zhǎng)模式以抵抗或逃避抗菌藥物的殺傷[36]。另一方面，QS系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)EP基因的表達(dá)，而EP可以有效地將抗菌藥物從細(xì)菌體內(nèi)排出，從而在耐藥過程發(fā)揮重要作用[35]。輔助基因調(diào)控(auxiliary gene regulation, Agr)QS系統(tǒng)是SA致病性的中心調(diào)節(jié)器，在細(xì)菌成熟、生物被膜的擴(kuò)散中起關(guān)鍵作用，并有助于形成新的定植位點(diǎn)[37]。研究[30]表明，抑制SA生物被膜中RNAIII激活肽的靶標(biāo)(target of RNAIII-activating peptide, TraP)QS受體，可減少細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖合成和基質(zhì)中eDNA含量，顯著提高頭孢菌素、萬古霉素、達(dá)托霉素、利奈唑胺、妥布霉素和夫西地酸對(duì)SA的抗菌效果。

2.5 EP導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性 EP在各種細(xì)菌中廣泛存在。細(xì)菌EP是一種存在于細(xì)胞膜上，從細(xì)胞膜內(nèi)外質(zhì)子或離子(如鈉)形成的化學(xué)梯度中獲取能量的二級(jí)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可將大部分臨床相關(guān)的抗菌藥物從細(xì)菌內(nèi)部排到細(xì)胞外，是細(xì)菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵機(jī)制[38]。EP在生物被膜發(fā)育中也發(fā)揮了重要作用：(1)輔助QS分子和群體淬滅(quorum quenching, QQ)分子外流促進(jìn)生物被膜基質(zhì)的形成；(2)間接調(diào)節(jié)生物被膜形成相關(guān)基因的表達(dá)[39]。在包含SA的革蘭陽(yáng)性菌中，主要協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族(major facilitator superfamily, MFS)在五個(gè)主要的EP家族中發(fā)揮重要作用[40]。SA MFS中的NorA EP作為SA最有效的耐多藥系統(tǒng)，可排出氟喹諾酮類抗菌藥物和季銨化合物，MepA EP也可排出氟喹諾酮類等不同類別的抗菌藥物[40-42]。在生物被膜生長(zhǎng)過程中，SA中EP基因mdeA、norB和norC的相對(duì)表達(dá)水平上調(diào)，其中norB和norC EP可以排出胞內(nèi)的西曲米和喹諾酮類等抗菌藥物，而MdeA EP可排出胞內(nèi)的季銨化合物(表面消毒劑)和抗菌藥物[43]。

3 結(jié)語

SA生物被膜對(duì)多種抗菌藥物耐藥，感染后患者發(fā)病率和病死率顯著增加，給臨床抗感染治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。本綜述旨在分析SA生物被膜在抗菌藥物耐藥性增加過程中的作用并介紹相關(guān)機(jī)制。盡管目前已經(jīng)對(duì)銅綠假單胞菌(研究最多的生物被膜模式菌)生物被膜進(jìn)行了大量研究，但是對(duì)SA等其他細(xì)菌生物被膜的研究相對(duì)較少。不同細(xì)菌生物被膜在耐藥性產(chǎn)生方面存在很大差異，SA作為細(xì)菌生物被膜感染中最常見的病原體之一，目前尚未探索出針對(duì)其生物被膜相關(guān)感染的有效治療策略。因此，需對(duì)SA生物被膜的耐藥機(jī)制進(jìn)行更多研究。SA生物被膜耐藥機(jī)制及具體過程仍不清楚，分析SA生物被膜耐藥的具體機(jī)制，有助于制定與其感染相關(guān)的新治療方案和策略。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。