黃德浩，黃麗，何文濤，賀妙蘭，葉紅斌，劉永，黃源林，胡輝，宋吉明

（1.惠州市九惠制藥股份有限公司，廣東惠州 516007；2.安徽大學(xué)，安徽合肥 230039）

連番止瀉方是南方醫(yī)科大學(xué)陳寶田教授的臨床驗(yàn)方，具有清熱解毒、燥濕止瀉的功效，由黃連、黃芩、白芍、廣藿香、番石榴葉、茯苓組成，常用于治療由人體輪狀病毒引起的急性腹瀉[1]。輪狀病毒多發(fā)于兒童，全球每年約20萬嬰幼兒因輪狀病毒感染而死亡[2]。連番止瀉已上市產(chǎn)品為膠囊劑，存在吞咽不便、用藥量不準(zhǔn)確等問題，因此，擬改劑型為顆粒劑；為解決顆粒劑存在味苦難以下咽的問題，本文將主要成分制成微丸中間體，便于后續(xù)研究包衣和混懸顆粒制劑[3-4]，并建立HPLC-雙波長檢測法同時(shí)測定微丸中鹽酸小檗堿、黃芩苷、白芍苷含量的方法[5-8]，為新劑型質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器與設(shè)備

Mini-250C 螺桿擠出滾圓機(jī)（深圳信宜特科技有限公司）；YK-160D 快速攪拌制粒機(jī)（丹東市制藥機(jī)械有限公司）；101A-2 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司）；LC-20A 高效液相色譜儀（日本島津公司）；MSE3.6P-0CE-DM 型百萬分之一天平、CPA225D 型十萬分之一天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；TH-350型超聲波清洗器（濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司）。

1.2 試劑與試藥

鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-202015，質(zhì)量分?jǐn)?shù)85.90%）、黃芩苷對照品（批號：110715-202122，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.20%）、芍藥苷對照品（批號：110736-202044，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.80%）均購自中國食品藥品檢定研究院；連番止瀉干膏粉（批號：20220401，惠州市九惠制藥股份有限公司自制）；微晶纖維素MCC（上海麥克林生化科技有限公司）；交聯(lián)羧甲基纖維素鈉（陜西唐堯生物科技有限公司）；滑石粉（上海麥克林生化科技有限公司）；聚維酮K30（博愛新開源醫(yī)療科技集團(tuán)股份有限公司）；甲醇（北京伊諾凱科技有限公司）；純化水（自制）；色譜乙腈（上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?；其他試劑為分析純?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 連番止瀉微丸處方工藝研究

2.1.1 微丸的制備工藝 取連番止瀉提取物干膏粉末和微晶纖維素等輔料適量分別過80 目篩，混勻，加水制軟材；按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的擠出轉(zhuǎn)速、滾圓轉(zhuǎn)速和滾圓時(shí)間，經(jīng)擠出機(jī)篩板擠出，將所得條狀物放滾圓機(jī)滾圓，取出微丸，于60 ℃烘干，篩出16～30目的微丸進(jìn)行分析評價(jià)。

2.1.2 評價(jià)指標(biāo) 收率（f）：f=W1/W0×100%，W0為微丸質(zhì)量，W1為過篩微丸質(zhì)量。圓整度：取過篩微丸，置平板，緩慢抬起平板一側(cè)，測量微丸開始滾動時(shí)傾斜平面與水平面所形成的夾角，即為平面臨界角（Φ），其值越小，圓整度越好。綜合評價(jià)指標(biāo)（Y）：Y=f-2Φ，f為收率，Y值越高，對應(yīng)工藝條件越優(yōu)[9]。

2.1.3 賦形劑的篩選 微晶纖維素（MCC）是一種成球促進(jìn)劑，由MCC 制得的微丸粒度均勻、表面圓整光滑、堆密度大，對于丸芯的形成和圓整度起關(guān)鍵性作用[10-11]。單獨(dú)使用MCC 做賦形劑，所得微丸脆碎度較高，故考慮加入其他賦形劑合用。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)表明微晶纖維素與交聯(lián)羧甲基淀粉鈉和乳糖的質(zhì)量比為4∶1∶3 時(shí)，制得的微丸圓整均勻，硬度適中，成丸性好，收率也高。

2.1.4 載藥量的考察 研究表明，采用擠出滾圓法制備微丸的載藥量為20%～50%時(shí)，利于成丸[12]。本試驗(yàn)分別考察了20%、30%、40%、50% 4種載藥量制備的微丸圓整度及收率，并觀察制備過程及外觀。結(jié)果顯示，載藥量越小越易成丸，最終選擇連番止瀉微丸的載藥量為20%。

2.1.5 潤濕劑種類及用量的考察 潤濕劑的種類和用量在擠出滾圓法制備微丸過程中具有關(guān)鍵性作用[13]。若藥物有一定黏性，應(yīng)使用合適濃度的乙醇作為潤濕劑[14-16]。連番止瀉提取物干膏粉的黏性適中，考察水、不同濃度的乙醇作為潤濕劑。依據(jù)“捏之成團(tuán)，松之不散”的標(biāo)準(zhǔn)[17]，結(jié)果表明，以水作為潤濕劑制軟材進(jìn)行比較順利，且微丸圓整度較好，綜合經(jīng)濟(jì)成本考慮，最終選擇以水為潤濕劑進(jìn)行微丸的制備。

2.1.6 微丸成型工藝優(yōu)化 影響制丸工藝主要因素為擠出轉(zhuǎn)速、滾圓轉(zhuǎn)速、滾圓時(shí)間。本研究選用三因素三水平按L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)作為工藝條件的優(yōu)化篩選，因素水平見表1，處方為：連番止瀉干膏粉∶微晶纖維素∶交聯(lián)羧甲基纖維素鈉∶乳糖=2∶4∶1∶3（質(zhì)量比），黏合劑為水。由表2 結(jié)果可知，3 個(gè)因素對微丸性質(zhì)影響的主次因素順序?yàn)锽＞A＞C，因素B（滾圓轉(zhuǎn)速）對微丸質(zhì)量影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。從正交結(jié)果分析表表3，最優(yōu)工藝條件為A2B3C1，即：擠出轉(zhuǎn)速為40 r/min，滾圓轉(zhuǎn)速為200 r/min，滾圓時(shí)間為90 min。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 2 Results of orthogonal test

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis of orthogonal test

2.1.7 工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 對處方和工藝考察確定的最優(yōu)工藝進(jìn)行驗(yàn)證（n=3）。進(jìn)行粉體學(xué)性質(zhì)的測定，結(jié)果均符合要求，說明工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好，見表4。

表4 3批微丸質(zhì)量評價(jià)結(jié)果Table 4 Quality evaluation of 3 batches of pellets

2.2 連番止瀉微丸含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil GOLDTMC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脫（0～3 min，15.5%～15.5%A；3～10 min，15.5%～28%A；10～25 min，28%～28%A；25～30 min，28%～40%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：230 nm（芍藥苷），280 nm（黃芩苷、鹽酸小檗堿）；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 對照品儲備液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品10.640 mg、黃芩苷對照品10.764 mg 和芍藥苷對照品10.661 mg 適量，分別置于10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別制成質(zhì)量濃度為0.914、1.014、1.032 mg/mL 的鹽酸小檗堿、黃芩苷、芍藥苷單一對照品儲備液。

2.2.3 混合對照品溶液的制備 取“2.2.2”項(xiàng)下對照品儲備液，精密量取適量，置20 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到含0.045 70 mg/mL鹽酸小檗堿、0.020 28 mg/mL 黃芩苷、0.020 64 mg/mL 芍藥苷的混合對照品溶液。

2.2.4 供試品溶液的制備 取供試品，研細(xì)，精密稱取0.1 g，置25 mL 量瓶中，加50%甲醇適量，超聲30 min（300 W，50 kHz），取出，放冷，50%甲醇定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.5 陰性對照溶液的制備 按處方制備缺黃連陰性樣品、缺黃芩陰性樣品、缺白芍陰性樣品，按照“2.2.4”項(xiàng)下方法前處理，得各陰性對照溶液。

2.2.6 專屬性試驗(yàn) 分別取混合對照品溶液、供試品溶液和各陰性對照溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀。按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件測定。結(jié)果顯示陰性對照無干擾，見圖1。

圖1 混合對照品（A）、連番止瀉微丸（B）、缺白芍陰性樣品（C）、缺黃芩陰性樣品（D）和缺黃連陰性樣品（E）的HPLC色譜圖Figure 1 HPLC Chromatograms of mixed reference substances (A),Lianfan Zhixie Pellets (B),sample without Paeonia lactiflora(C),sample without Scutellaria baicalensis(D),and sample without Rhizoma coptidis(E)

2.2.7 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項(xiàng)下單獨(dú)對照品儲備液，精密量取適量，置25 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到含0.109 7 mg/mL 鹽酸小檗堿、0.040 6 mg/mL 黃芩苷、0.041 3 mg/mL 芍藥苷的混合對照品溶液。精密吸取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，分別用甲醇定容至10 mL，搖勻即得系列線性工作溶液。按“2.2.1”項(xiàng)下方法測定，以各對照品質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到鹽酸小檗堿、黃芩苷和芍藥苷的線性回歸方程分別為：A小檗堿=36 665x-3 305.6（r=0.999 9）；A黃芩苷=39 129x-1 773.6（r=0.999 9）；A芍藥苷=14 321x-255.5（r=0.999 8），表明鹽酸小檗堿、黃芩苷、芍藥苷質(zhì)量濃度分別在10.968～109.680 μg/mL、4.056～40.560 μg/mL、4.128～41.279 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.8 精密度試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下對照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)6次進(jìn)樣10 μL，計(jì)算峰面積RSD 值。結(jié)果鹽酸小檗堿、黃芩苷、芍藥苷峰面積RSD 值分別為1.61%、1.83%、1.53%，表明儀器精密度良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次連番止瀉微丸樣品6 份，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按“2.2.1”項(xiàng)分別進(jìn)樣10 μL，計(jì)算6份供試品溶液中鹽酸小檗堿、黃芩苷、芍藥苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示，6 份供試品溶液中鹽酸小檗堿、黃芩苷、芍藥苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10.87、4.62、1.58 mg/g，RSD 值分別為0.38%、1.04%、1.44%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品溶液，在配制后0、2、4、8、12、24 h 于同一色譜條件下分別進(jìn)樣10 μL，計(jì)算峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果鹽酸小檗堿、黃芩苷、芍藥苷峰面積值的RSD 分別為1.03%、1.74%、1.10%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.11 加樣回收率試驗(yàn) 將“2.2.2”項(xiàng)下的對照品儲備液適量，單獨(dú)配制成質(zhì)量濃度為0.457 0 mg/mL鹽酸小檗堿對照品溶液、0.202 8 mg/mL黃芩苷對照品溶液、0.103 2 mg/mL芍藥苷對照品溶液。取已測定含量的連番止瀉微丸0.05 g，精密稱定，置25 mL量瓶，稱取6份，分別按表5所示加入鹽酸小檗堿、黃芩苷、芍藥苷對照品溶液適量，按“2.2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，計(jì)算鹽酸小檗堿、黃芩苷、芍藥苷的加樣回收率。結(jié)果見表5。鹽酸小檗堿、黃芩苷、芍藥苷的平均回收率分別為98.35%、97.90%、98.01%；RSD 分別為1.38%、1.60%、1.18%（n=6），表明方法準(zhǔn)確度良好。

表5 鹽酸小檗堿、黃芩苷、芍藥苷的加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The recoveries of berberine hydrochloride,baicalin and paeoniflorin

2.2.12 耐用性試驗(yàn) 分別精密吸取同一份供試品溶液10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件考察Hypersil GOLDTTMC18（250 mm×4.6 μm,5 μm）、JADE-PAK RS-C18（250 mm×4.6 μm，5 μm）、Inertsil ODS-SP C18（250 mm×4.6μm,5μm）3 種色譜柱下，鹽酸小檗堿、黃芩苷、芍藥苷含量測定結(jié)果受影響的程度，結(jié)果顯示圖譜中各色譜峰除保留時(shí)間有點(diǎn)差別外，理論塔板數(shù)和拖尾因子均理想，表明使用不同的色譜柱對檢測結(jié)果沒有影響，見表6。

表6 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Durability test results w/（mg·g-1）

3 討論

實(shí)驗(yàn)中微丸的粉體學(xué)性質(zhì)可以用得率、圓整度、脆碎度、堆密度等多個(gè)指標(biāo)來考察，但在整個(gè)處方和工藝因素的選擇過程中，微丸堆密度、脆碎度兩指標(biāo)均無顯著性差別，而脆碎度除對工藝因素略有影響外，處方考察中變化不大，故本文選取得率和圓整度的綜合評分作為評價(jià)微丸成型性的主要指標(biāo)來優(yōu)化處方。

本文考察得到制備連番止瀉微丸的最終優(yōu)化處方為：連番止瀉干膏粉∶微晶纖維素∶交聯(lián)羧甲基纖維素鈉∶乳糖=2∶4∶1∶3（質(zhì)量比），黏合劑為水，擠出轉(zhuǎn)速為40 r/min，滾圓轉(zhuǎn)速為200 r/min，滾圓時(shí)間為90 min。但微丸質(zhì)量受制備過程影響較大，本文試驗(yàn)條件所限，試驗(yàn)量較小，如投入生產(chǎn)，還需綜合考慮滾圓過程中，微丸與微丸之間的擠壓碰撞等因素。

中藥復(fù)方化學(xué)成分十分復(fù)雜，選擇能夠反映該中藥主要藥效的有效成分作為指標(biāo)對其進(jìn)行控制，可化繁為簡，較好地達(dá)到控制藥品質(zhì)量的目的。本文以連番止瀉微丸中的君藥黃連，臣藥黃芩和芍藥中主要有效成分鹽酸小檗堿、黃芩苷及芍藥苷作為指標(biāo)性成分。根據(jù)紫外檢測，芍藥苷的最大吸收波長為230 nm，黃芩苷和鹽酸小檗堿的最大吸收波長為280 nm，故選擇230 nm 檢測芍藥苷、280 nm 檢測黃芩苷和鹽酸小檗堿。試驗(yàn)過程中，鹽酸小檗堿與黃芩苷的保留時(shí)間相近，改良流動相后，確定以乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脫對連番止瀉微丸中鹽酸小檗堿、芍藥苷和白芍苷分離效果較好。本文建立的檢測方法專屬性良好、精密度和準(zhǔn)確度高，為后續(xù)快速準(zhǔn)確檢測連番止瀉微丸的指標(biāo)性成分提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。