楊 盛 劉 鑫 邢亞桓

肺癌為胸部惡性腫瘤，癌細(xì)胞來源于支氣管黏膜上皮[1]。據(jù)流行病學(xué)顯示，肺癌發(fā)生率與死亡率逐年上升，且男性發(fā)病人群多于女性[2]。小細(xì)胞肺癌不同于非小細(xì)胞肺癌具有典型癥狀，且病情發(fā)展快、惡性程度高，患者生存時間較短[3]。故早期診斷治療對延長患者生存時間具有重要意義。二代測序(NGS)技術(shù)發(fā)展使基因檢測進入高通量測序時代，該技術(shù)檢測樣本范圍廣，檢測通量大、效率高，其特異性強且靈敏度高[4-5]。隨著NGS測序技術(shù)在臨床中的逐步應(yīng)用，研究表明小細(xì)胞肺癌的基因突變頻率較高，在其發(fā)生發(fā)展中存在多個驅(qū)動基因異常。BRCA2基因是有27個外顯子組成，定位于染色體13q12.3上，存在無義、移碼、缺失等多種形式突變。BRCA突變后使蛋白質(zhì)產(chǎn)物減少、蛋白質(zhì)功能出現(xiàn)障礙。目前臨床對非小細(xì)胞肺癌的BRCA2基因突變研究較多，關(guān)于廣泛期小細(xì)胞肺癌的研究相對較少[6]。為此，本研究通過研究廣泛期小細(xì)胞肺癌患者的基因突變情況與一線化療方案療效，分析BRCA2基因突變狀態(tài)與化療后生存期關(guān)系，為臨床治療及評估預(yù)后提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，選擇2019年3月至2020年6月我院89例廣泛期小細(xì)胞肺癌患者，其中男性46例，女性43例；年齡為39～70歲，平均(57.36±10.28)歲；吸煙情況：吸煙65例、不吸煙24例；解剖類型：中央型78例、周圍型11例。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理診斷確診為廣泛期小細(xì)胞肺癌[7]；初始治療前接受NGS檢測；簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：局限期小細(xì)胞肺癌患者；合并其他惡性腫瘤患者；血壓無法控制患者；肝腎功能衰竭患者；精神疾病或意識障礙患者。

1.2 方法

一線化療方案：患者入組后給予依托泊苷以100 mg/m2標(biāo)準(zhǔn)并聯(lián)合鉑類方案化療，以21 d為一個療程；當(dāng)出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)終止實驗，不良反應(yīng)參照美國國立癌癥研究通用的毒性標(biāo)準(zhǔn)[8]。

抽取患者化療前清晨空腹靜脈血，離心后取上層清液冷凍保存。

NGS檢測方法[9]：采用Ion Torrent測序技術(shù)進行NGS檢測。文庫制備：采用科吉安(來源于北京雅康博生物科技有限公司)肺癌文庫制備試劑盒。①文庫制備前采用定量儀(Qubit 3.0)初步估測樣本中DNA濃度，當(dāng)DNA濃度超過1.7 ng/ml且量超過10 ng表示樣本合格。②向樣本中加DNA PCR反應(yīng)液，混勻后加入引物、DNA、無核酸酶水，設(shè)置PCR參數(shù)循環(huán)22次：第一階段參數(shù)為99 ℃、3 min，第二階段為99 ℃、15 s，第三階段60 ℃、4 min。③向樣本中加入引物消化液，再次行PCR，參數(shù)設(shè)置：第一階段50 ℃、10 min，第二階段55 ℃、10 min，第三階段60 ℃、20 min，反應(yīng)后放于恒溫箱中備用。④樣本中加入連接緩沖液、DNA連接酶行連接接頭PCR，參數(shù)設(shè)置：第一階段22 ℃、30 min，第二階段72 ℃、10 min，反應(yīng)后放恒溫箱備用。⑤制備后的樣本放入EP管，加純化磁珠混勻后于恒溫箱內(nèi)孵育，取上層液放于另一EP管內(nèi)，加70%乙醇轉(zhuǎn)洗磁珠，沉淀后去其上層液，重復(fù)1次后完成純化連接產(chǎn)物。⑥純化后的樣本加PCR緩沖液行缺口連接、擴增，完成5個循環(huán)，參數(shù)設(shè)置：第一階段98 ℃、2 min，第二階段98 ℃、15 s，第三階段60 ℃、1 min。⑦按步驟⑤進行文庫純化，采用定量儀進行定量。制備測序模板與富集：采用IonPGMTMTemplate OT2 Reagents 200試劑盒(來源于Life Tech公司)。①樣本加入EP管內(nèi)混勻放冰盒中備用；②向樣本中加無核酸酶水、PCR緩沖液、PCR酶、稀釋后的文庫，將其混勻后作擴增液；③將擴增液連續(xù)3次打入模板制備器內(nèi)，加制備反應(yīng)油繼續(xù)油包水PCR反應(yīng)，反應(yīng)后離心去除溶液，取下層油包水產(chǎn)物移入新EP管中，加無核酸酶水震蕩離心去溶液，加模板重懸液。④取吐溫、氫氧化鈉制備Melt-off溶液；⑤取磁珠100 μl放入EP管內(nèi)，除去液體，加C1磁珠清液混勻，去除上層液，向EP管中加C1磁珠重懸液混勻。⑥樣本放入陽性模板中富集。測序：采用IonPGMTMSequencing Supplies 200 v2試劑盒(來源于Life Tech公司)。①儀器清洗后初始化，W1瓶內(nèi)加氫氧化鈉，W2瓶內(nèi)加測序溶液Ⅱ，W3瓶內(nèi)加測序溶液Ⅲ進行第一階段初始化；根據(jù)機器所示位置將試劑管分別放在標(biāo)記的G、C、A、T位置行第二階段初始化；②富集產(chǎn)物與質(zhì)控模板混勻后離心，去除上層液，加緩沖液與測序溶液后退火，參數(shù)設(shè)置：第一階段95 ℃、2 min，第二階段37 ℃、2 min，第三階段25 ℃保存。③于服務(wù)器中輸入試劑盒信息，設(shè)置編號，上樣、測序；使用VariantCaller插件分析樣本測序。

1.3 觀察指標(biāo)

療效評估標(biāo)準(zhǔn)：患者經(jīng)治療后行胸部增強CT或MRI檢查，根據(jù)檢查結(jié)果判斷：影像學(xué)檢查顯示病灶消失，且持續(xù)時間≥4周為完全緩解(CR)；病灶長徑相對于首次縮小≥30%表示部分緩解(PR)；病灶長徑縮小<30%或增加不足20%為疾病穩(wěn)定(SD)；病灶長徑較首次檢查增加超過20%，或其他部位有新病灶為疾病進展(PD)。PR與SD代表病情控制，PD代表病情未控制[10]。無進展生存期(PFS)為終末時間與初始時間之差[11]；患者首次就診為初始時間，疾病進展患者發(fā)生死亡時為終末時間。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 患者BRCA2基因突變情況比較

經(jīng)NGS技術(shù)檢測，BRCA2基因突變12例，突變率為13.48%。不同性別、年齡、吸煙史患者BRCA2基因突變率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，周圍型患者BRCA2基因突變率高于中央型(P<0.05)。見表1。

表1 患者BRCA2基因突變情況比較(例，%)

2.2 患者BRCA2基因突變與一線化療PFS的關(guān)系

患者化療后PR 14例、SD 47例、PD 28例；隨訪結(jié)果顯示，患者中位PFS為4.8個月。單因素顯示，患者性別、年齡、有無吸煙、解剖類型對其PFS無顯著影響(P>0.05)，病情有無控制、BRCA2基因是否突變對PFS有顯著影響(P<0.05)，見表2。

表2 BRCA2基因突變與一線化療PFS的關(guān)系

2.3 BRCA2基因與PFS相關(guān)性分析

經(jīng)Cox回歸分析顯示，一線化療療效、BRCA2基因突變狀態(tài)是患者PFS的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 患者BRCA2基因與PFS的Cox模型分析

3 討論

小細(xì)胞肺癌惡性程度高、病情發(fā)展快、預(yù)后差。不同于其他類型腫瘤，小細(xì)胞肺癌診斷的前驅(qū)癥狀時間較短，確診后不及時治療，患者生存期不超過3個月[12]。研究顯示，由于患者早期癥狀不典型，大多患者確診時處于廣泛期，有淋巴道或血行轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[13]。手術(shù)切除治療對小細(xì)胞肺癌的效果較差，但該腫瘤對放化療具有較高的敏感性。目前治療廣泛性小細(xì)胞肺癌的一線化療方案為依托泊苷與鉑類藥物聯(lián)合化療，但部分患者化療過程中易出現(xiàn)不耐受而使疾病無進展[14]。隨著基因檢測技術(shù)不斷發(fā)展，靶向治療為攜帶特定基因突變的肺癌患者重要治療方式[15]。目前基因測序雖能檢測小細(xì)胞肺癌大多基因突變，但關(guān)于其基因突變與臨床問題研究相對較少。隨著基因檢測技術(shù)進步與肺癌免疫治療開展，腫瘤基因突變負(fù)荷被逐漸了解，是腫瘤基因組外顯子區(qū)域出現(xiàn)非同義突變總數(shù)。BRCA2基因突變在乳腺癌中研究較多，在肺癌中研究較少，目前尚無文獻(xiàn)報道BRCA2基因突變與小細(xì)胞肺癌間的關(guān)系[16]。為此，本研究對兩者間的相關(guān)性進行研究。

BRCA2基因位于染色體13q12.3，是由27個外顯子組成，3418個氨基酸組成其編碼蛋白。BRCA2蛋白氨基末端有轉(zhuǎn)錄激活域，中間部分由外顯子11編碼且含有與RAD51結(jié)合的反復(fù)序列，其羧基末端有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，有助于促進BRCA2蛋白和單鏈或雙鏈DNA結(jié)合[17]。BRCA突變繼發(fā)功能喪失使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤干細(xì)胞或起源細(xì)胞，并促進腫瘤發(fā)生發(fā)展[18]。目前發(fā)現(xiàn)BRCA2基因存在無義突變、缺失突變及移碼突變等1800多種形式，多數(shù)BRCA突變后蛋白質(zhì)產(chǎn)物下降或其功能出現(xiàn)障礙。小細(xì)胞肺癌的發(fā)生與吸煙因素有關(guān)，多發(fā)于男性人群，但臨床中仍有小部分患者為女性及不吸煙人群[19]。故探究該部分患者基因突變能進一步認(rèn)識該類患者相關(guān)特征。通過二代測序檢測基因突變，89例患者中12例有BRCA2基因突變，性別、年齡、吸煙史對BRCA2基因突變率無顯著影響。經(jīng)PFS比較發(fā)現(xiàn)，性別、吸煙等因素與一線化療PFS無相關(guān)性，患者BRCA2基因突變的PFS短于未突變患者；進一步Cox分析顯示，一線化療療效、BRCA2基因突變是影響PFS的獨立危險因素，該結(jié)論與國內(nèi)外研究一致[20-21]。

綜上所述，廣泛期小細(xì)胞肺癌患者的BRCA2基因突變是影響其化療PFS的獨立危險因素，NGS技術(shù)檢測基因突變能有效評估患者療效與預(yù)后，在臨床中具有重要意義。