張 劍 楊薈玉 張自森 王利娟 張紅巧 郭彥偉

原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤和第3位的腫瘤致死病因，嚴(yán)重地威脅我國(guó)人民的生命健康[1-2]。AHCS治療經(jīng)皮穿刺肝癌，通過(guò)高壓氬氣的超低溫以及高壓氦氣產(chǎn)生的熱效應(yīng)最大限度的殺傷腫瘤組織[3]。大量的研究指出， AHCS-TACE聯(lián)合治療在中晚期肝癌患者中療效更佳[4]，并且安全性較佳。但有研究指出，AHCS-TACE治療可能只在部分患者中提供明顯的生存益處。目前，在臨床實(shí)踐中尚缺乏識(shí)別AHCS-TACE聯(lián)合療法最佳響應(yīng)者的生物標(biāo)志物[5-6]。探索一種高特異性的生物標(biāo)志物以區(qū)分AHCS-TACE聯(lián)合治療響應(yīng)良好的患者，能夠顯著的改善中晚期肝癌的治療效果，并降低患者的醫(yī)療成本，具有重要的臨床意義。Tim-3表達(dá)于腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞中，參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的免疫殺傷效應(yīng)[7]。有研究指出免疫殺傷效應(yīng)在AHCS-TACE聯(lián)合療法的抗腫瘤效應(yīng)中扮演關(guān)鍵角色[8]。此外，臨床研究指出Tim-3的表達(dá)含量上升與患者的疾病進(jìn)展以及不良預(yù)后顯著相關(guān)[9]。在本次研究中，我們探索了免疫細(xì)胞表面Tim-3表達(dá)含量與AHCS-TACE聯(lián)合治療響應(yīng)的相關(guān)性，以期為T(mén)ACE+AHCS聯(lián)合治療的患者提供一種高特異性的生物標(biāo)志物，從而實(shí)現(xiàn)療效不佳的患者進(jìn)行提早區(qū)分以及個(gè)體化治療從而改善患者的預(yù)后。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年11月至2020年11在我院接受TACE-AHCS聯(lián)合治療的肝細(xì)胞癌患者共102例。本研究的納入標(biāo)準(zhǔn)為：①患者年齡在18～75歲之間；②根據(jù)EASL或AASLD指南確診為診斷為肝細(xì)胞癌；③BCLCB或C期，不具備手術(shù)切除或移植的候選資格；④Child-Pugh A或B級(jí)；⑤腎功能正常(血清肌酐濃度1.5倍或低于正常范圍的上限)；⑥ECOG評(píng)分為0～2分。排除標(biāo)準(zhǔn)：①門(mén)靜脈主干完全被癌栓栓塞；②有肝臟切除或肝臟移植史；③接受過(guò)靶向治療或全身性的化療。在接受治療前，進(jìn)行腫瘤活檢，對(duì)腫瘤樣本進(jìn)行免疫組化檢測(cè)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中Tim-3蛋白表達(dá)水平。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞上Tim-3蛋白陽(yáng)性率>5%，被定義為T(mén)im-3高表達(dá)。102例患者，根據(jù)Tim-3蛋白陽(yáng)性率是否>5%，分為T(mén)im-3高表達(dá)組以及Tim-3低表達(dá)組。本研究已被我院倫理道德委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 治療方法

TACE的治療方法如文獻(xiàn)所示[10]，這里簡(jiǎn)述如下：由三位介入科醫(yī)生進(jìn)行介入治療。置入5-Fr YASHIRO或RH導(dǎo)管，并進(jìn)行內(nèi)臟血管造影以評(píng)估肝動(dòng)脈供應(yīng)。將2.7-F微導(dǎo)管置入合適位置，并緩慢注射5～20 ml脂碘醇與20～40 mg表柔比星，直到血流減慢。最后，必要時(shí)注射350～560 μm的聚乙烯醇顆粒，以減少腫瘤血流。動(dòng)脈化療栓塞術(shù)后14天，復(fù)查血常規(guī)、凝血常規(guī)及肝腎功，復(fù)查CT觀察碘油沉積情況，排除禁忌證后，簽署知情同意書(shū)后行超聲聯(lián)合CT引導(dǎo)下氬氦刀冷凍消融治療。手術(shù)由CT掃描引導(dǎo)。應(yīng)用氬氣低溫消融系統(tǒng)和17號(hào)冷凍消融針進(jìn)行。使用1至5個(gè)冷凍消融針，以實(shí)現(xiàn)冰球完全覆蓋腫瘤，隨后重復(fù)CT掃描觀察消融范圍，確保冰球邊界超過(guò)靶區(qū)邊緣5 mm以上，關(guān)閉氬氣并切換氦氣復(fù)溫至20 ℃以上，再次重復(fù)以上氬氣冷凍-氦氣復(fù)溫循環(huán)；5 min后復(fù)查胸腹部CT，觀察有無(wú)胸腔及腹腔出血。術(shù)后給予生命體征監(jiān)測(cè)、保肝、補(bǔ)液及對(duì)癥支持治療5～7天。視復(fù)查情況間隔4～6周重復(fù)以上治療過(guò)程。

1.3 觀察指標(biāo)

所有患者均通過(guò)門(mén)診復(fù)查或電話隨訪至2021年11月，隨訪時(shí)間為12～60個(gè)月，平均(34±11)個(gè)月，記錄患者疾病復(fù)發(fā)及生存情況。本次研究的主要終點(diǎn)包括：總生存期(OS)，定義為從第一次TACE治療開(kāi)始到死亡或最后一次隨訪的時(shí)間。次要終點(diǎn)包括腫瘤反應(yīng)和腫瘤進(jìn)展時(shí)間(TTP)，腫瘤進(jìn)展時(shí)間是指從第一次TACE治療開(kāi)始到放射性腫瘤進(jìn)展、死亡或最后一次隨訪的時(shí)間。腫瘤評(píng)價(jià)指標(biāo)包括客觀反應(yīng)率(ORR)，包括完全反應(yīng)(CR)和部分反應(yīng)(PR)病例。入院時(shí)對(duì)并發(fā)癥進(jìn)行臨床觀察，出院后通過(guò)電話訪談進(jìn)行評(píng)估。

1.4 T淋巴細(xì)胞亞群水平檢測(cè)

在治療后應(yīng)用ELISA實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)所有患者T淋巴細(xì)胞亞群水平，包括CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平，T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)abcam公司，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 23.0版軟件進(jìn)行。2組之間的連續(xù)變量用mean±SD表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。分類變量用百分比和頻率表示，并使用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較。生存曲線用Kaplan-Meier方法構(gòu)建，組間生存差異分析采用Log-rank檢驗(yàn)用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行比較。使用Cox's回歸模型進(jìn)行各種參數(shù)的單變量和多變量分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者一般資料比較

本次研究Tim-3低表達(dá)患者54例，Tim-3高表達(dá)患者48例。2組患者在性別、ECOG評(píng)分、Child-Pugh分級(jí)、腫瘤大小、AFP水平、有無(wú)門(mén)靜脈侵犯相關(guān)指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表1。

表1 2組患者一般資料(例，%)

2.2 2組患者客觀緩解率對(duì)比

治療3月之后，Tim-3低表達(dá)組患者的ORR為74.1%，Tim-3高表達(dá)組患者的ORR為39.6%，Tim-3低表達(dá)組患者對(duì)TACE-AHCS聯(lián)合治療的響應(yīng)優(yōu)于Tim-3高表達(dá)組患者，數(shù)據(jù)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.177,P<0.05)，如表2所示。

表2 2組患者ORR比較(例，%)

2.3 2組患者中遠(yuǎn)期療效對(duì)比

2組患者均進(jìn)行了為期3年的隨訪，在最后一次隨訪中，Tim-3低表達(dá)組患者和Tim-3高表達(dá)組分別有14例以及5例患者存活。Tim-3低表達(dá)組的中位OS為27.07月，Tim-3高表達(dá)組為19.79個(gè)月，2組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.714，P<0.05)。Tim-3低表達(dá)組的中位TTP為16.41個(gè)月，而Tim-3高表達(dá)組為11.49個(gè)月，數(shù)據(jù)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=22.886，P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 2組患者中遠(yuǎn)期療效比較

2.4 2組患者治療后T淋巴細(xì)胞亞群水平比較分析

TACE-AHCS聯(lián)合治療3月后，Tim-3低表達(dá)組患者的CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T細(xì)胞水平均顯著高于Tim-3高表達(dá)組患者，數(shù)據(jù)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，如表3所示。

表3 2組患者治療3月后T淋巴細(xì)胞亞群水平

2.5 2組患者中遠(yuǎn)期療效的預(yù)后因子分析

單因素分析顯示，有無(wú)腹水、有無(wú)門(mén)靜脈瘤栓、肝內(nèi)腫瘤最大直徑、腫瘤生長(zhǎng)方式以及Tim-3表達(dá)含量與OS和TTP顯著相關(guān)(P<0.05)，此外，多因素分析顯示，有無(wú)門(mén)靜脈瘤栓和肝內(nèi)腫瘤的最大直徑以及Tim-3表達(dá)含量是OS和TTP的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的預(yù)后因素(P<0.05) ，如表4、5所示。

表4 影響患者TTP的預(yù)后因子分析

表5 影響患者OS的預(yù)后因子分析

3 討論

原發(fā)性肝癌是第4位的常見(jiàn)惡性腫瘤和第3位的腫瘤致死病因。盡管在過(guò)去的幾十年里已經(jīng)開(kāi)發(fā)了各種治療方法，但晚期肝癌的預(yù)后仍然很差[11]。目前的研究評(píng)估了TACE聯(lián)合冷凍消融，研究指出聯(lián)合組的完全緩解率和總有效率明顯高于TACE組[4]。TACE聯(lián)合AHCS可以為不可切除的HCC患者帶來(lái)更多益處。聯(lián)合治療的效果明顯優(yōu)于單獨(dú)的TACE或AHCS，且無(wú)重大并發(fā)癥發(fā)生。然而，TACE聯(lián)合AHCS治療可能只有部分患者受益，但目前尚缺乏識(shí)別良好響應(yīng)患者的生物標(biāo)志物。

本研究評(píng)估了Tim-3低表達(dá)組以及Tim-3高表達(dá)組患者對(duì)TACE聯(lián)合AHCS治療的響應(yīng)程度，及其對(duì)患者預(yù)后的意義。Tim-3低表達(dá)組以及Tim-3高表達(dá)組的中位OS(27.07月VS.19.79月，P=0.0001)和中位TTP(16.41月VS.11.49月，P=0.001)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，多因素分析顯示，有無(wú)門(mén)靜脈瘤栓的存在和肝內(nèi)腫瘤的最大直徑以及Tim-3表達(dá)含量是OS和TTP的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的預(yù)后因素。此項(xiàng)研究的研究結(jié)果表明，Tim-3表達(dá)含量可以作為肝癌患者對(duì)TACE聯(lián)合AHCS治療的預(yù)測(cè)因子。

Tim-3是一個(gè)較少被研究的免疫檢查點(diǎn)分子，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和誘導(dǎo)免疫耐受方面發(fā)揮著重要而復(fù)雜的作用。在部分肝癌患者肝癌組織的腫瘤細(xì)胞、腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞、Tregs和TAMs中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Tim-3的異常表達(dá)[12-13]。有研究指出，Tim-3的高表達(dá)與肝癌患者的預(yù)后顯著相關(guān)。例如，Hastings等[14]研究發(fā)現(xiàn)，HCC組織中Tim-3+腫瘤浸潤(rùn)性T細(xì)胞的數(shù)量越多，患者的生存期越短。此外，Tim-3在外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)可用于預(yù)測(cè)治療性肝切除的HCC患者的復(fù)發(fā)[15]。復(fù)發(fā)性HCC患者在肝臟切除前后，外周血單核細(xì)胞中Tim-3+ CD4+T細(xì)胞和Tim-3+ CD8+T細(xì)胞的比例明顯高于非復(fù)發(fā)性HCC患者。然而，目前探討肝癌中Tim-3表達(dá)含量對(duì)患者治療響應(yīng)的研究較少。

在本次研究中，我們的研究結(jié)果指出，在治療后與Tim-3低表達(dá)組相比，Tim-3高表達(dá)組患者CD8+T細(xì)胞水平顯著降低。CD8+T細(xì)胞是發(fā)揮抗腫瘤功能的TILs的最重要組成部分。HCC中大量的CD8+TILs與合理的預(yù)后相關(guān)，包括改善OS、延長(zhǎng)無(wú)復(fù)發(fā)生存期和延緩疾病進(jìn)展[16]。CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞可以直接接觸并通過(guò)穿孔蛋白和顆粒酶裂解靶細(xì)胞，或通過(guò)Fas/FasL信號(hào)傳導(dǎo)和分泌IFN-γ和TNF誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。Zhou G等[17]證明，Tim-3+的CD8+T細(xì)胞顯示出最低水平的顆粒酶B、IFN-γ和TNF-α，此外機(jī)制研究指出，Tim-3與其配體Gal-9接觸能夠促CD8+T細(xì)胞耗竭。

此外，本研究結(jié)果表明，在治療后與Tim-3低表達(dá)組相比，Tim-3高表達(dá)組患者CD4+T細(xì)胞水平顯著降低。CD4+T細(xì)胞在HCC中發(fā)揮著從效應(yīng)細(xì)胞功能到調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的截然不同的作用[18]。CD4+Th1細(xì)胞在抗原刺激下產(chǎn)生高水平的IFN-γ和TNF-α，負(fù)責(zé)細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體和腫瘤細(xì)胞的免疫[19]。有研究指出，Tim-3能夠介導(dǎo)Th1細(xì)胞凋亡，Th1細(xì)胞的喪失能夠促進(jìn)肝癌的疾病進(jìn)程生長(zhǎng)[20]。這些研究均揭示了Tim-3高表達(dá)組患者預(yù)后較差的可能機(jī)制。

綜上所述，Tim-3低表達(dá)組患者可能對(duì)TACE+AHCS聯(lián)合治療響應(yīng)更好，治療前，腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞中Tim-3含量對(duì)TACE+AHCS聯(lián)合治療患者預(yù)后具有預(yù)測(cè)價(jià)值?；赥im-3的高表達(dá)模式，應(yīng)用Tim-3的免疫檢查點(diǎn)抑制劑進(jìn)行維持治療，可能會(huì)改善接受TACE+AHCS聯(lián)合治療的患者的預(yù)后和完全反應(yīng)率。