劉 翼 吳 強(qiáng) 楊龍海 周孜孜 張曉明 曾 薇

肺癌是目前世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均位于所有惡性腫瘤之首[1]。早期非小細(xì)胞肺癌患者缺乏特異癥狀且診斷方法有限，大多數(shù)患者被診斷時(shí)已處于腫瘤晚期，不適合進(jìn)行手術(shù)切除，5 年生存期僅不足20%[2]。因此,確定與肺癌密切相關(guān)的新型分子靶點(diǎn)具有重大意義。KCNT2基因編碼鈉激活鉀通道蛋白SLICK，SLICK具有較大的單導(dǎo)性并被細(xì)胞內(nèi)鈉離子和氯離子所激活，在細(xì)胞的去極化過(guò)程中表現(xiàn)出明顯的活化動(dòng)力，有助于鉀離子向細(xì)胞外流動(dòng)，從而降低和調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性[3]。既往的研究表明KCNT2突變與癲癇性腦病的發(fā)生有關(guān)[4-6]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，KCNT2在胃癌[7]、黑色素瘤[8]組織中低表達(dá)，并且和預(yù)后相關(guān)，提示KCNT2 可作為潛在的預(yù)后預(yù)測(cè)因子。然而,關(guān)于KCNT2 在肺腺癌中的表達(dá)變化及意義目前仍缺乏研究報(bào)道。本研究通過(guò)下載整理癌癥基因組圖譜(TCGA) 數(shù)據(jù)庫(kù)中2021 年5月30日之前納入的肺腺癌表達(dá)譜數(shù)據(jù)及患者臨床信息,分析KCNT2 在肺腺癌中的表達(dá)變化,探討KCNT2 與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性,并分析KCNT2 作用相關(guān)信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1 原始數(shù)據(jù)的下載及預(yù)處理

從TCGA 官方網(wǎng)站(https://portal.gdc.cancer.gov/) 檢索并下載肺腺癌的表達(dá)譜數(shù)據(jù)及相應(yīng)臨床信息。其中,基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)包括肺腺癌組織樣本497例,正常肺組織樣本59例，納入相關(guān)臨床樣本385例。整理RNA-seq樣本并使用R語(yǔ)言進(jìn)行歸一化處理，同時(shí)對(duì)患者臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選和整理，刪除臨床資料中失訪及目標(biāo)信息不完整的病例。提取KCNT2單基因樣本及相對(duì)應(yīng)的臨床資料樣本，分析目標(biāo)基因在腫瘤和正常肺組織的表達(dá)差異。

1.2 KCNT2 表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性分析及驗(yàn)證

從385例臨床樣本中選取性別、年齡、T 分期、N分期、 M分期、AJCC分期作為肺腺癌臨床病理特征指標(biāo)，去除臨床病理特征缺失或者不完全的病例69例，以KCNT2 在肺腺癌組織中表達(dá)水平的中位值(0.143)為界限,將肺腺癌患者分為KCNT2 高表達(dá)組(150例)和KCNT2 低表達(dá)組(166例)，通過(guò)χ2檢驗(yàn)比較兩組臨床病理特征的差異。根據(jù)在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載整理的肺腺癌患者的臨床信息,結(jié)合KCNT2表達(dá)量,利用單因素及多因素COX 分析KCNT2 表達(dá)與肺腺癌患者臨床病理特征相關(guān)性；將樣本KCNT2表達(dá)量和生存信息結(jié)合，分析KCNT2高表達(dá)組、低表達(dá)組總體生存率(OS)的差異；利用Kaplan-Meier Plotter在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)肺腺癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行生存分析，進(jìn)一步驗(yàn)證KCNT2的預(yù)后價(jià)值。

1.3 基因富集分析(GSEA)

應(yīng)用GSEA 4.1.0版本軟件對(duì)應(yīng)分析KCNT2高表達(dá)組和低表達(dá)組對(duì)相關(guān)基因的影響。選用GSEA中C2.cp.kegg.V7.4.symbols.gmt規(guī)范化基因集，運(yùn)用缺省加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)方法，每次分析對(duì)基因組進(jìn)行1000次排列。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 25.0軟件，用Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析KCNT2在肺腺癌組織和肺正常組織樣本中的表達(dá)差異；對(duì)KCNT2表達(dá)水平與肺腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性進(jìn)行χ2檢驗(yàn)；單因素及多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型用于評(píng)價(jià)KCNT2與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系；生存分析使用Kaplan-Mier法，生存曲線(xiàn)比較采用Log-rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌組織、正常肺組織中KCNT2 表達(dá)水平的比較

KCNT2表達(dá)水平肺腺癌組織低于正常肺組織(P<0.01)(圖1)。在52對(duì)配對(duì)的肺腺癌組織與癌旁正常組織樣本中,腫瘤組織KCNT2 表達(dá)水平較癌旁正常肺組織也顯著下調(diào)(P<0.01)(圖2)。

圖1 TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集中KCNT2在正常肺組織和肺腺癌組織中的表達(dá)比較

圖2 TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集中52對(duì)配對(duì)的肺癌組織和癌旁組織中KCNT2的表達(dá)比較

2.2 KCNT2基因表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

肺腺癌組織中KCNT2基因表達(dá)水平與患者年齡、性別、Stage分期、T分期、M分期、N分期無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，與患者Stage分期相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表1；單因素COX分析結(jié)果顯示,Stage分期、T分期、N分期均可以作為肺腺癌潛在的預(yù)后因素(P<0.01)；多因素COX回歸分析結(jié)果提示,Stage分期(HR=1.947,95% CI:1.236-3.066，P=0.004) 可以作為肺腺癌的獨(dú)立預(yù)后影響因素(表2)。

表1 KCNT2 基因表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系/例

表2 肺腺癌患者單因素和多因素 COX 回歸分析結(jié)果

2.3 KCNT2表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系

KCNT2低表達(dá)與肺腺癌患者不良預(yù)后有關(guān)(P=0.035)(圖3)。KaplanMeier-plotter 在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果表明,KCNT2低表達(dá)肺腺癌患者的OS 較低(P=0.017)(圖4)。

圖3 TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集中KCNT2表達(dá)量與患者預(yù)后的關(guān)系

圖4 KaplanMeier-plotter 在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)分析KCNT2表達(dá)量與患者預(yù)后的關(guān)系

2.4 KCNT2基因相關(guān)信號(hào)通路

KCNT2基因低表達(dá)樣本主要富集在氧化磷酸化信號(hào)通路、核糖體、嘧啶代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、RNA聚合酶等信號(hào)通路中(表3)。

表3 KCNT2的功能富集分析

3 討論

肺癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)生率和死亡率最高的腫瘤，肺腺癌屬于非小細(xì)胞肺癌的一類(lèi)，是原發(fā)性肺癌中發(fā)生率最高的亞型，占到全部肺癌病例的40%且呈現(xiàn)持續(xù)上漲的趨勢(shì)[9]。由于缺乏早期臨床癥狀，很多肺癌患者確診時(shí)已進(jìn)入進(jìn)展期，治療效果不佳。發(fā)現(xiàn)新的分子標(biāo)記物能夠?qū)Ψ伟┑脑\斷及治療提供理論依據(jù)，意義重大。

在電生理學(xué)或分子水平上有一類(lèi)離子敏感性K離子通道，由細(xì)胞質(zhì)Na離子升高而激活，這個(gè)家族，統(tǒng)稱(chēng)為鈉激活鉀離子通道(KNa )。該通道首先在豚鼠心肌細(xì)胞中被鑒定[10]，隨后，在各種神經(jīng)元中報(bào)道了該通道[11-12]。KCNT1(SLACK)與 KCNT2(SLICK)同為編碼鈉激活鉀離子通道家族蛋白的基因，有76%的結(jié)構(gòu)相似性，兩者共同形成一個(gè)四聚體通道，介導(dǎo)一系列神經(jīng)元細(xì)胞的鈉敏感性鉀電流[13]。KCNT1 編碼鈉激活鉀離子通道(KNa )，是目前已知最大的鉀通道亞單位，在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，參與癲癇的發(fā)病機(jī)制[14]。KCNT2和KCNT1具有類(lèi)似的單通道電導(dǎo)作用，也可以通過(guò)細(xì)胞外Na離子激活。人類(lèi)KCNT2基因約為400 kb，與大鼠氨基酸序列具有98%的同源性，表現(xiàn)出很強(qiáng)的進(jìn)化保守性。與KCNT1相比，KCNT2通道對(duì)細(xì)胞內(nèi)氯化物更敏感，KCNT2激活非常迅速[15]。研究顯示，與KCNT1通道相比，KCNT2通道是唯一對(duì)細(xì)胞體積微小變化敏感的鉀通道[16]。Danielle等研究顯示KCNT2的表達(dá)受NFκB的控制,由于神經(jīng)元NFκB的激活發(fā)生在缺氧和損傷等應(yīng)激刺激過(guò)程中，因此KCNT2是一個(gè)神經(jīng)保護(hù)基因[17]。最近的研究表明，KCNT2在一些腫瘤組織中也存在異常表達(dá)的情況，Lan等研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織及細(xì)胞系中KCNT2低表達(dá)，在胃癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)KCNT2，可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]。我們的研究采用 TCGA 肺腺癌數(shù)據(jù)庫(kù)分析正常肺組織與肺腺癌組織中KCNT2基因表達(dá)差異，并用臨床數(shù)據(jù)分析其表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)肺腺癌組KCNT2 的表達(dá)水平低于正常對(duì)照組(P<0.05)；KCNT2 低表達(dá)組生存率低于KCNT2 高表達(dá)組(P=0.035)；單因素、 多因素 Cox 分析表明Stage 分期(HR=1.947,95% CI:1.236～3.066，P=0.004)可以作為肺腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素。GSEA分析首先運(yùn)用預(yù)定義的基因集，將基因按照在兩組樣本中的表達(dá)差異程度進(jìn)行排序，而后檢驗(yàn)預(yù)定義的基因集是否富集在排序表的頂端或者底部，是當(dāng)下研究基因表達(dá)差異富集信號(hào)通路的理想生物信息學(xué)方法。本研究利用GSEA方法預(yù)測(cè)KCNT2可能的調(diào)控信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)KCNT2 基因低表達(dá)樣本主要富集在氧化磷酸化信號(hào)通路、核糖體、嘧啶代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、RNA聚合酶等信號(hào)通路中。

綜上所述,肺腺癌組織中 KCNT2 基因低表達(dá),且與預(yù)后相關(guān),可能是肺腺癌診斷和治療的潛在生物標(biāo)志物。 本研究利用 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中肺腺癌的測(cè)序數(shù)據(jù),納入大量樣本,臨床資料相對(duì)完整,為后續(xù)研究KCNT2基因在肺腺癌中的發(fā)生機(jī)制及相關(guān)臨床研究提供依據(jù)。在后續(xù)的研究中，課題組將采用 qPCR、Western blot和免疫組織化學(xué)法驗(yàn)證KCNT2(SLICK)的表達(dá)情況,并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制,為肺腺癌的基因靶向治療提供新思路。