孫永梅 焦 鵬

肺癌是常見惡性腫瘤之一，在所有腫瘤中致死率位居第一。非小細(xì)胞癌細(xì)胞與小細(xì)胞癌相比生長(zhǎng)分裂慢，擴(kuò)散相對(duì)較晚[1]。雖然臨床已采用手術(shù)、放化療等綜合治療手段，但治療效果并不理想。靶向治療近來在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用[2]。有研究表明miR-129-5p異常表達(dá)與多種腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)[3-4]。但miR-129-5p在非小細(xì)胞肺癌中的生物學(xué)功能研究較少。本研究通過探討miR-129-5p對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響及其可能的作用機(jī)制，分析其在非小細(xì)胞肺癌疾病進(jìn)展中作用，為臨床靶向治療非小細(xì)胞癌提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549、NCI-H157、GLC-82(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫)；Trizol提取試劑盒(賽默飛世爾科技中國有限公司)；BCA蛋白試劑盒、Lipofectamin 2000試劑盒(瑞士Roche公司)；RPMI 146、DMEM培養(yǎng)基(南通市百奧邁科生物公司)；MTT實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑(美國Promega公司)；Transwell實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑購(美國BioLEgend公司)；兔源一抗(β-catemin、Cy-clin D1，MMP-2、MMP-9、JAK、p-STAT3、STAT3、c-myc、GAPDH)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(美國Cell Signal Technology公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 肺癌細(xì)胞株A549、NCI-H157、GLC-82均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 146培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2濃度。將第3代A549細(xì)胞以4×105/孔接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天取細(xì)胞培養(yǎng)箱于顯微鏡下觀察細(xì)胞密度，細(xì)胞80%融合更換不含胎牛血清的新鮮RPMI 146培養(yǎng)基即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染試劑稀釋輕輕混勻，室溫孵育5 min記為混合物1。另將miR-129-5p mimics、miR-129-5p NC分別稀釋于500 μL無血清培養(yǎng)基中調(diào)整終濃度為20 μmol/l，室溫孵育5 min，記為混合物B。將A和B輕輕混勻，室溫孵育20 min，分別加入相應(yīng)培養(yǎng)孔，另設(shè)不添加轉(zhuǎn)染試劑作為對(duì)照組。6 h后棄去培養(yǎng)基，更換含10%胎牛血清的RPMI 146培養(yǎng)基。48h后收集細(xì)胞供后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 熒光實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)法檢測(cè) 收集各組已處理細(xì)胞，參照Trizol說明書提取總RNA，進(jìn)行qRT-PCR操作。miR-129-5p和內(nèi)參U6引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列詳見表1。2-ΔΔCt算法計(jì)算miR-129-5p相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 蛋白質(zhì)印記(Westernblot)法檢測(cè) 將蛋白裂解buffer(含protease inhibitor Cocktail)加入1.2.1中各組細(xì)胞提取總蛋白。BCA蛋白試劑盒測(cè)定細(xì)胞中總蛋白含量，以GAPDH為內(nèi)參，采用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白β-catemin、Cyclin D1，侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9及STAT3通路相關(guān)蛋白JAK、p-STAT3、STAT3、c-myc、GAPDH蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍照并進(jìn)行定量分析。做3次重復(fù)，取平均值。

1.2.4 MTT試驗(yàn) 將1.2.1中各組細(xì)胞接種96孔板，在0、24、48、72、96 h時(shí)間點(diǎn)每孔加入10 μl濃度為1.5 mg/ml的MTT，培養(yǎng) 4 h后各孔內(nèi)加入150 μl DMSO，讀取各孔吸光度值(A)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，以未接種細(xì)胞只加培養(yǎng)基孔的A值為空白對(duì)照調(diào)零。

1.2.5 平板克隆試驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種在12孔板中，細(xì)胞密度調(diào)整為1×104個(gè)/ml，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)10 d，PBS溶液清洗后采用4%甲醛固定菌落30 min，1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，水洗干燥后拍照統(tǒng)計(jì)算細(xì)胞克隆數(shù)量。

1.2.6 細(xì)胞侵襲試驗(yàn) 收集各組細(xì)胞，取100 μl的Matrigel膠平鋪于上層小室。上室每孔加入細(xì)胞懸液100 μl(細(xì)胞數(shù)約為1×105，無血清培養(yǎng)基稀釋)，下室加入500 μl含10% FBS的完全培養(yǎng)基。37 ℃孵育24 h。取出小室，用PBS沖洗兩遍，用棉簽除去濾膜上室面的細(xì)胞和Matrigel膠，1% 多聚甲醛固定下室面細(xì)胞后加入Giemsa染色30min。用倒置顯微鏡隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)，并拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值表示細(xì)胞的侵襲能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 非小細(xì)胞癌細(xì)胞系中miR-129-5p相對(duì)表達(dá)量

BEAS-2B、A549、NCI-H157、GLC-82細(xì)胞株中，miR-129-5p相對(duì)表達(dá)量分別為(1.01±0.21)(0.17±0.04)、(0.72±0.18)、(0.68±0.16)，后三者均顯著低于正常細(xì)胞株BEAS-2B中miR-129-5p相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，其中A549細(xì)胞株中miR-129-5p表達(dá)量下降最顯著。后續(xù)試驗(yàn)選取A549細(xì)胞株。見圖1。

圖1 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株miR-129-5p相對(duì)表達(dá)量

2.2 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

倒置熒光顯微鏡下觀察miR-429 NC組、miR-429 mimics組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均達(dá)90%以上，與空白組相比，miR-129-5p NC組miR-129-5p相對(duì)表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)，miR-129-5p mimics組miR-129-5p相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)；與miR-129-5p NC組相比，miR-129-5p mimics組miR-129-5p相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)，見表2。

表2 三組miR-129-5p相對(duì)表達(dá)量

2.3 miR-129-5p過表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響

MTT試驗(yàn)顯示，miR-129-5p NC組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞OD值與空白組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-129-5p mimics組48 h 開始細(xì)胞OD值顯著低于空白組(P<0.05)及miR-129-5p NC組(P<0.05)，見圖2。

注：a為與空白組相比，P<0.05；b為miR-129-5p NC組比較，P<0.05。

2.4 平板克隆法檢測(cè)miR-129-5p過表達(dá)對(duì)增殖能力的影響

與空白組相比，miR-129-5p NC組細(xì)胞形成數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-129-5p mimics組細(xì)胞形成數(shù)顯著降低(P<0.05)；與miR-129-5p NC組相比，miR-129-5p mimics組細(xì)胞形成數(shù)顯著降低(P<0.05)。

2.5 miR-129-5p過表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell試驗(yàn)顯示，miR-129-5p NC組侵襲細(xì)胞數(shù)與空白組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-129-5p mimics組侵襲細(xì)胞數(shù)與空白組相比顯著降低(P<0.05)；與miR-129-5p NC組相比，miR-129-5p mimics組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)，見圖3、表3。

表3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-129-5p過表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響

2.6 miR-129-5p過表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)顯示，與空白組相比，miR-129-5p NC組增殖相關(guān)蛋白β-catemin、Cyclin D1、侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-129-5p mimics組β-catemin、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與miR-129-5p NC組相比，miR-129-5p mimics組β-catemin、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),見圖4、表4。

表4 miR-129-5p過表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.7 miR-129-5p過表達(dá)對(duì)STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組相比，miR-129-5p NC組JAK激酶、p-STAT3、STAT3、c-myc蛋白表達(dá)差異不顯著(P>0.05)，miR-129-5p mimics組JAK激酶表達(dá)水平、STAT3磷酸化水平、c-myc表達(dá)水平降低(P<0.05)；與miR-129-5p NC組相比，miR-129-5p mimics組JAK激酶表達(dá)水平、STAT3磷酸化水平、c-myc表達(dá)水平降低(P<0.05)，見表5、圖5。

注：a為空白組,b為miR-129-5p NC組,c為miR-129-5p mimics組。

注：a為空白組,b為miR-129-5p NC組,c為miR-129-5p mimics組。

表5 Western blot檢測(cè)STAT3通路蛋白表達(dá)情況

注：a為空白組；b為miR-129-5p NC組；c為miR-129-5p mimics組。

3 討論

非小細(xì)胞癌是肺癌的一種，包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、大細(xì)胞癌，約占所有肺癌的80%，因?yàn)槿狈?duì)非小細(xì)胞肺癌早期有效診斷指標(biāo)，約75%患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，5年內(nèi)生存率很低[5-7]。因此尋求非小細(xì)胞癌的靶點(diǎn)具有重大意義。近年來，miRNA在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用受到廣泛關(guān)注[8]。有臨床研究表明，miR-129-5p在非小細(xì)胞癌中過表達(dá)，其表達(dá)水平與肺癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和預(yù)后有關(guān)[9-10]。因此本研究通過轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-129-5p，研究miR-129-5p對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響及其可能的作用機(jī)制。

Zhang等[11]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-129-5p在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)水平顯著低于其對(duì)應(yīng)正常黏膜組織，上調(diào)miR-129-5p表達(dá)后，癌細(xì)胞增殖速率降低，且c-myc及clyclinD1蛋白的表達(dá)明顯下降，猜測(cè)miR-129-5p上調(diào)可以有效地抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)其凋亡。You等[12]研究表明，亞油酸苯胺羥肟酸可通過上調(diào)miR-129-5p誘導(dǎo)硫氧還蛋白1介導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。Shen等[13]也表明，miRNA-129-5p在喉癌組織中低表達(dá)。Xu等[14]經(jīng)研究顯示miRNA-129-5p在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的組織和細(xì)胞系中呈下調(diào)狀態(tài)。本研究中選取正常細(xì)胞株BEAS-2B和三株非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、NCI-H157、GLC-82作為研究對(duì)象，經(jīng)qRT-PCR法檢測(cè)，A549、NCI-H157、GLC-82細(xì)胞株miRNA-129-5p表達(dá)均低于BEAS-2B，推測(cè)miRNA-129-5p可能參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，其中A549細(xì)胞株miRNA-129-5p相對(duì)表達(dá)量最低，因此后續(xù)試驗(yàn)均選用A549細(xì)胞株。A549細(xì)胞株轉(zhuǎn)染miR-129-5p mimics使之過表達(dá)后，miR-129-5p表達(dá)水平顯著高于空白組與miR-129-5p NC組，表明轉(zhuǎn)染效率較高。MTT和平板克隆試驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染后miR-129-5p mimics組48 h后OD值、克隆形成數(shù)顯著低于空白組，提示miR-129-5p過表達(dá)參與非小細(xì)胞肺癌增殖過程，增殖相關(guān)蛋白β-catemin、Cyclin D1表達(dá)也顯著降低，提示miR-129-5p過表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。腫瘤細(xì)胞具有高度的侵襲能力，可侵入鄰近區(qū)域，并通過降解細(xì)胞外基質(zhì)成分轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處器官，MMP-2和MMP-9在腫瘤細(xì)胞的局部侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。本研究顯示，miR-129-5p過表達(dá)顯著降低細(xì)胞侵襲能力，進(jìn)一步研究顯示，miR-129-5p過表達(dá)后侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低，推測(cè)miR-129-5p可能參與非小細(xì)胞肺癌癌細(xì)胞侵襲過程。

STAT3通路是近年來發(fā)現(xiàn)的一條參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程的信號(hào)通路[15]。STAT3是STAT家族的一員，大量研究表明STAT3在多種癌癥中被持續(xù)激活，其除受細(xì)胞因子、G蛋白偶聯(lián)受體、鈣黏著蛋白結(jié)合、Toll樣受體調(diào)節(jié)外，還受到miRNA的調(diào)節(jié)，在癌癥發(fā)生發(fā)展中具有至關(guān)重要的地位[16-18]。有學(xué)者[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR-1181可能通過靶向STAT3參與胰腺癌細(xì)胞的侵襲和增殖。Shen等[13]研究表明，miR-129-5p對(duì)喉癌細(xì)胞具有抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用，且miR-129-5p的抗腫瘤作用是通過調(diào)控STAT3信號(hào)通路下游靶基因c-myc實(shí)現(xiàn)，據(jù)此猜測(cè)，miR-129-5p對(duì)STAT3信號(hào)通路可能通過類似調(diào)控發(fā)揮作用。本研究顯示，miR-129-5p過表達(dá)使STAT3信號(hào)通路JAK激酶水平、STAT3磷酸化程度降低，致使c-myc表達(dá)水平下降?？赡苡捎趍iR-129-5p過表達(dá)抑制JAK激酶表達(dá)，進(jìn)而抑制STAT3蛋白轉(zhuǎn)錄，最終下調(diào)靶基因c-myc的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制腫瘤的增殖、侵襲過程。

綜上所述，本研究上調(diào)miR-129-5p可抑制非小細(xì)胞肺癌增殖、侵襲過程，可能通過抑制STAT3信號(hào)通路激活實(shí)現(xiàn)，有望成為非小細(xì)胞肺癌治療的靶點(diǎn)。