尚娜娜 董雪茹 劉 志

胰腺癌是一類病因多且復(fù)雜、發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤，據(jù)報(bào)道該類患者5年生存率小于5%[1]。有學(xué)者通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)基因(T Lymphoma invasion and metastasis inducing gene 1,Tiam1)蛋白作為一類高保守、高敏感基因，可通過(guò)HCG/c-MET信號(hào)通路而特異性調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。而Tiam1在非小細(xì)胞肺癌、腎癌等多種惡性腫瘤中均有表達(dá)[3-4]，考慮Tiam1蛋白可能介導(dǎo)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)控胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲等生物學(xué)行為。但參閱國(guó)內(nèi)外研究文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)關(guān)于 Tiam1蛋白、PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在胰腺癌中作用機(jī)制的報(bào)道較少，因此本研究就此展開(kāi)報(bào)道，以期深入分析胰腺癌轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)相關(guān)機(jī)制及治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織及細(xì)胞 收集2017年1月至2019年12月本院手術(shù)切除的胰腺癌組織及癌旁組織各106例，術(shù)中將組織置于液氨冷凍后放入-80 ℃保存。人胰腺癌細(xì)胞株SW1990購(gòu)自上海通派生物科技有限公司。

1.1.2 慢病毒轉(zhuǎn)染 收集處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的人胰腺癌SW1990細(xì)胞接種于6孔板，每孔5×104個(gè)；培養(yǎng)液用含10% FBS的DMEM，培養(yǎng)箱條件：37 ℃ 5% CO2。待細(xì)胞爬滿孔板80%左右，吸出培養(yǎng)液并采用PBS清洗，加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)24 h，采用LipofectAMINE 2000轉(zhuǎn)染試劑盒將攜帶慢病毒的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞體內(nèi)，培養(yǎng)72 h，熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光細(xì)胞占比超過(guò)80%為轉(zhuǎn)染成功。

1.1.3 HGF溶液制備 粉末狀HGF用二甲亞颯(DMSO)溶解配置成含HGF 50 mg/mL的溶液，倒入EP管，置于-80 ℃保存，使用時(shí)按需用DMEM進(jìn)行稀釋。

1.1.4 試劑與儀器 試劑：RIPA蛋白裂解液(北京雷根生物技術(shù)有限公司)，F(xiàn)BS、DMEM(北京沃比森科技有限公司)，BCA試劑盒(上海嵐派生物科技有限公司)，ECL發(fā)光試劑盒(上海喬羽生物科技有限公司)，LipofectAMINE 2000轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)(美國(guó)賽默飛)，空白Tiam1質(zhì)粒pGenesill-shRNA、Tiam1質(zhì)粒pMag-3x-iRFP(武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司)，DMSO(美國(guó)Promega公司)，PBS緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)，CCK-8試劑盒(上海酶聯(lián)免疫生物有限公司)，Transwell小室(廣州維德昕生物科技有限公司)，4% HCHO(山東淄博齊星化學(xué)科技有限公司)。儀器：倒置熒光顯微鏡(德國(guó)徠卡DMi8型)、CO2培養(yǎng)箱(上海航佩儀器有限公司W(wǎng)J-Ⅱ型)、PCR儀(廣州鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)、MR-100酶標(biāo)儀(山東博冠生物技術(shù)有限公司BK-EL10C)。

1.2 方法

1.2.1 Western Blot法檢測(cè)Tiam1、PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)量 取細(xì)胞用PBS溶液沖洗，加蛋白裂解液處理30 min，在4 ℃條件下以12000 rpm離心15 min，取上清液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，合格后取總蛋白上樣進(jìn)行電泳，以β-actin為內(nèi)參，獲取的蛋白條采用軟件計(jì)算待測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期SW1990細(xì)胞制成懸液后接種于96孔板，每孔約2×103個(gè)，采用濃度為50 ng/mL的HGF溶液和生理鹽水處理并作為HGF組和空白組，轉(zhuǎn)染Tiam1 minic作為T(mén)iam1組；在顯微鏡下觀察到貼壁生長(zhǎng)后分別加入10 μL CCK8，并在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)；分別在0、12、24、48、60 h時(shí)采用酶標(biāo)儀測(cè)定兩組溶液在450 nm處的光密度(optical density, OD)值，計(jì)算HGF對(duì)胰腺癌增殖作用，細(xì)胞增殖率=(研究組細(xì)胞OD/空白組細(xì)胞OD)×100%。分別于0 h,12 h,24 h,48 h,60 h時(shí)計(jì)算Tiam1蛋白對(duì)過(guò)表達(dá)HGF胰腺癌細(xì)胞增殖作用。

1.2.3 Transwell小室實(shí)驗(yàn) 取單細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔約2×103個(gè)，分為空白組、HGF組、Tiam1組。于Transwell小室上、下室中分別加入60 μL基質(zhì)膠、含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后棄上室液體，4% HCHO固定15 min，然后進(jìn)行HE染色，觀察并計(jì)算穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)，重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn) 取上述實(shí)驗(yàn)中3組細(xì)胞用胰酶消化，吹打成2×108個(gè)/L懸液并接種于48孔板，待細(xì)胞爬滿孔板80%左右，用移液槍頭垂直方向劃痕，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察并計(jì)算細(xì)胞遷移距離。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的連續(xù)變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組間比較行t檢驗(yàn)，多組間比較行單因素方差分析，組間兩兩比較采用Snk-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組和癌旁正常組細(xì)胞Tiam1表達(dá)情況分析

Tiam1在胰腺癌組織中呈高表達(dá)，在癌旁正常組織中呈低表達(dá)(圖1)。胰腺癌組和癌旁正常組細(xì)胞Tiam1表達(dá)量分別為(4.11±0.40)、(1.98±0.29)，胰腺癌組織中Tiam1表達(dá)量高于癌旁正常組織中Tiam1表達(dá)量(P<0.05)。

圖1 胰腺癌組和癌旁正常組細(xì)胞Tiam1表達(dá)圖(Western Blot法)

2.2 三組胰腺癌細(xì)胞增殖率分析

各組在轉(zhuǎn)染0 h、12 h時(shí)細(xì)胞增殖率比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。轉(zhuǎn)染24 h、48 h、60 h時(shí)，與空白組比較，Tiam1組和HGF組細(xì)胞增殖率升高，且Tiam1組高于HGF組(P<0.05)(圖2)。

注：*為與空白組比較，P<0.05；#為與HGF組比較，P<0.05。

2.3 三組細(xì)胞侵襲能力

Tiam1組穿過(guò)小室細(xì)胞數(shù)較多，經(jīng)過(guò)HE染色后染色細(xì)胞較其他兩組更明顯；空白組、HGF組穿膜細(xì)胞數(shù)更少，且HGF組低于空白組(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

注：*為與空白組比較，P<0.05；#為與HGF組比較，P<0.05。

2.4 三組細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力分析

與空白組比較，Tiam1組和HGF組轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，且Tiam1組高于HGF組(P<0.05)(圖4)。

圖4 空白組、HGF組和Tiam1組細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力(×100)

2.5 Tiam1蛋白介導(dǎo)HGF激活PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路

與空白組比較，Tiam1組和HGF組Tiam1、PI3K、Akt、HGF表達(dá)均增強(qiáng)，且Tiam1組Tiam1、PI3K、Akt、HGF表達(dá)量高于HGF組(P<0.05)(圖5)。

圖5 3組細(xì)胞PI3K-Akt-mTOR相關(guān)蛋白表達(dá)圖

3 討論

通過(guò)靶向免疫系統(tǒng)、腫瘤微環(huán)境及腫瘤基質(zhì)等抑制相關(guān)細(xì)胞受體，調(diào)節(jié)胰腺癌發(fā)生細(xì)胞數(shù)為目前胰腺癌治療新領(lǐng)域。Tiam1蛋白在大多數(shù)正常組織中呈低表達(dá)或不表達(dá)狀態(tài)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在多種惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)：有研究顯示Tiam1在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)高表達(dá)Tiam1組癌細(xì)胞侵襲能力更高、生存率低；翁丹丹等[5]指出高表達(dá)Tiam1可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移過(guò)程；張瑤等[6]的報(bào)道顯示，Tiam1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，且與腫瘤惡性程度密切相關(guān)，可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境的相互作用。本文胰腺癌組織中Tiam1表達(dá)量高于癌旁正常組織，說(shuō)明Tiam1表達(dá)可促進(jìn)胰腺上皮腫瘤發(fā)生。既往研究報(bào)道顯示，隨著肺癌TNM分期及分級(jí)提高，Tiam1表達(dá)量逐漸增高，說(shuō)明Tiam1表達(dá)可能促進(jìn)癌癥進(jìn)展[7]。本研究中Tiam1蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈片狀或彌漫不均一分布,參考Liu等[8]的文獻(xiàn)結(jié)果，考慮Tiam1定位可能與腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。Tiam1調(diào)控胰腺癌疾病進(jìn)展途徑不容忽視，可就此探討miRNAs干擾技術(shù)對(duì)腫瘤進(jìn)行治療的可能。本次結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞遷移水平更高，提示Tiam1可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力提高。

Tiam1蛋白可特異性結(jié)合激素和神經(jīng)遞質(zhì)而激發(fā)一系列生理反應(yīng)，參考Feng等[9]發(fā)現(xiàn)Tiam1蛋白通過(guò)相關(guān)信號(hào)通路增強(qiáng)人骨肉瘤組織增殖、侵襲能力。研究顯示PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞多種生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要作用，主要機(jī)制為與包膜上HGF因子及其受體結(jié)合而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞黏附和癌細(xì)胞增殖[10]。當(dāng)病原體感染機(jī)體后，Tiam1蛋白可被大量激活而促進(jìn)HGF分泌，大量HGF進(jìn)入細(xì)胞核參與激活HGF/c-MET轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而提高多種促細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及周期調(diào)控蛋白表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)癌細(xì)胞進(jìn)展[11]。綜合考慮，Tiam1蛋白是否為參與HGF/c-MET信號(hào)通路活化關(guān)鍵蛋白，進(jìn)而調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，影響胰腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲行為。本文胰腺癌細(xì)胞經(jīng)HGF誘導(dǎo)后，生長(zhǎng)曲線圖顯示出過(guò)表達(dá)HGF可有效增強(qiáng)癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，且該作用機(jī)制存在時(shí)間-劑量依賴性[12]，HGF特異性結(jié)合活化c-MET參與促進(jìn)血管瘤發(fā)生發(fā)展，繼而激活下游多種信號(hào)通路。進(jìn)一步探討HGF激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路機(jī)制發(fā)現(xiàn)，Tiam1蛋白過(guò)表達(dá)時(shí)，HGF誘導(dǎo)的PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路被阻斷，提示Tiam1蛋白在胰腺癌細(xì)胞中參與介導(dǎo)HGF誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路活化。

綜上所述，Tiam1蛋白在胰腺癌中呈高表達(dá)，主要通過(guò)激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路而增強(qiáng)癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力，有望成為胰腺癌治療的新靶點(diǎn)。