李一鳴，周 冉，孟露露，夏政怡，焦 嬌，胡 平，許爭峰，王 艷

[南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院(南京市婦幼保健院)產(chǎn)前診斷中心，南京 210004]

自然流產(chǎn)是妊娠早期最常見的并發(fā)癥，發(fā)生率約為15%，其中80%發(fā)生在妊娠前三個月[1-2]。自然流產(chǎn)按流產(chǎn)次數(shù)可分為偶發(fā)性自然流產(chǎn)(sporadic abortion,SA)和復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(recurrent miscarriage,RM)。2019年美國生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(American Society for Reproductive Medicine,ASRM)將RM定義為兩次或兩次以上的臨床妊娠丟失[3]，其發(fā)生率約為5%[4-5]。RM病因復(fù)雜，主要包括遺傳、母體、環(huán)境及男方因素等，其中胚胎染色體異常是最常見的原因，約占30%～57%[6]。2019年ASRM指南推薦RM行遺傳學(xué)檢查，通過對流產(chǎn)物進(jìn)行胚胎遺傳學(xué)檢查，可明確RM的遺傳學(xué)病因，減輕患者心理負(fù)擔(dān)，并為遺傳咨詢和下一次妊娠風(fēng)險評估提供重要信息[3]。

傳統(tǒng)的G顯帶染色體核型分析是RM遺傳學(xué)檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，可檢出多倍體、異倍體、嵌合體和大部分染色體大片段結(jié)構(gòu)異常，但無法發(fā)現(xiàn)10Mb以下的染色體拷貝數(shù)異常(copy number variations,CNVs)，且存在檢測周期長、母體細(xì)胞污染(maternal cell contamination,MCC)和培養(yǎng)失敗率高等局限性[7]。熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization,FISH)無需細(xì)胞培養(yǎng)，但僅能對幾條特定染色體行異倍體檢查，檢測能力有限[8]。近年來，隨著高分辨率分子遺傳學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展，染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis,CMA)在臨床上已被廣泛應(yīng)用于自然流產(chǎn)病例的遺傳學(xué)病因檢測[7]。該技術(shù)可在全基因組水平內(nèi)同時檢測染色體數(shù)目異常、大片段結(jié)構(gòu)異常、染色體微缺失微重復(fù)和單親二體(uniparental disomy,UPD)等，具有分辨率高、檢測周期短、成功率高和通量高等優(yōu)勢。張等[9]研究顯示，CMA相較于傳統(tǒng)核型技術(shù)，在早期流產(chǎn)胚胎中能額外檢測出4.3%的致病性微缺失/微重復(fù)(CNVs<10Mb)。既往RM遺傳學(xué)研究樣本量較小(51～777例)[6,8]，且側(cè)重于評估異倍體與RM的相關(guān)性[10]，微缺失/微重復(fù)與RM的相關(guān)性報道較少，并且關(guān)于流產(chǎn)次數(shù)與胚胎染色體異常率的關(guān)系存在爭議[11-12]。本研究采用CMA技術(shù)對1355例RM病例行胚胎遺傳學(xué)檢查，評估CMA技術(shù)在RM遺傳學(xué)診斷中的應(yīng)用價值，并進(jìn)一步探討流產(chǎn)次數(shù)與胚胎染色體異常率的關(guān)系以及復(fù)發(fā)性(≥2次)致病性微缺失/微重復(fù)與RM的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2011年8月至2021年9月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院就診的1355例RM病例，采用新鮮流產(chǎn)絨毛行CMA檢測。RM定義為2次及以上的自然流產(chǎn)。患者平均年齡為30.9歲(21～44歲)，平均孕周為9.5周(6～14周)?；颊咝蠧MA檢測前均已簽署知情同意書，本研究獲得南京市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法 采用組織提取試劑盒(QIAGEN公司，德國)從流產(chǎn)絨毛樣本中提取基因組DNA。采用HumanCytoSNP-12芯片(Illumina，美國)和CytoScan750K芯片(Affymetrix，美國)對絨毛DNA進(jìn)行CMA檢測，按標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作[13]。CMA檢出MCC的絨毛標(biāo)本進(jìn)一步行熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative fluorescent polymerase chain reaction,QF-PCR)檢測確定胚胎絨毛與母體蛻膜的比例。MCC比例超過30%為重度MCC，重度MCC病例排除在外。根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)和臨床基因組資源機(jī)構(gòu)(ClinGen)制定的CNVs致病性評估指南[14]，將CNVs分為以下5類：致病性CNVs、可能致病性CNVs、臨床意義不確定的CNVs(variant of uncertain significance,VOUS)、可能良性CNVs和良性CNVs。可能良性和良性CNVs不予報告。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以例數(shù)和頻率(%)表示，采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法進(jìn)行組間統(tǒng)計學(xué)比較，采用二元logistic回歸矯正母親年齡，分析胚胎染色體異常檢出率與既往流產(chǎn)次數(shù)的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床特征 排除14例(1.0%,14/1355)重度MCC病例，共1341例RM病例納入最終研究。1341例RM病例中，<35歲組1096例(81.7%,1096/1341)，35～39歲組184例(13.7%,184/1341)，≥40歲組61例(4.5%,61/1341)；流產(chǎn)2次968例(72.2%,968/1341)，3次294例(21.9%,294/1341)，≥4次79例(5.9%,79/1341)。

2.2 總體致病性染色體異常的頻率及分布 RM病例中總體致病性染色體異常檢出率為60.6%(813/1341)，其中異倍體44.5%(597/1341)、多倍體8.4%(113/1341)、大片段結(jié)構(gòu)異常(>10Mb)為5.0%(67/1341)、致病性微缺失/微重復(fù)(<10Mb)為1.9%(25/1341)、UPD為0.8%(11/1341)。RM病例致病性染色體異常的頻率及分布，見表1。

表1 RM病例致病性染色體異常的頻率及分布

2.3 染色體數(shù)目異常及UPD 本研究共發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目異常710例(52.9%,710/1341)，包括單個異倍體564例(42.0%,564/1341)，多個異倍體33例(2.5%,33/1341)，多倍體113例(8.4%,113/1341)。單個異倍體中以常染色體三體最常見(81.4%,459/564)，其次是X染色體單體(17.0%,96/564),常染色體單體(1.2%,7/564)和性染色體三體(0.4%,2/564)相對少見。33例多個異倍體病例中，包含雙重三體22例，三重三體3例(1例49,XX,+14,+18,+20、1例49,XX,+7,+13,+16和1例49,XX,+6,+10,+21)，四重三體1例(50,XXX,+2,+7,+9)，單體合并三體5例(1例46,X,+7、1例46,X,+18、1例46,X,+8、1例46,X,+9和1例47,XXX,-13,+15)，1例48,XXXY和1例48,XY,+16,+16。113例多倍體中，檢出三倍體91例(6.8%,91/1341)，亞三倍體8例(0.6%,8/1341)，超三倍體10例(0.7%,10/1341)，四倍體4例(0.3%,4/1341)。本研究還檢出11例全基因組UPD(0.8%,11/1341)。

2.4 致病性CNVs 共檢出92例致病性CNVs，其中大片段結(jié)構(gòu)異常67例(5.0%,67/1341)，致病性微缺失/微重復(fù)25例(1.9%,25/1341)，CNVs片段大小從0.24Mb至91.89Mb不等。CNVs在染色體中的分布見圖1，除14號染色體外，其余染色體均檢出致病性CNVs，其中6號和8號CNVs最常見。大片段結(jié)構(gòu)異常在8號和6號染色體最常見，致病性微缺失/微重復(fù)在16號和22號染色體最常見。67例染色體大片段缺失/重復(fù)中，檢出“末端缺失/重復(fù)”15例(1.1%,15/1341)，“中間缺失/重復(fù)”5例(0.4%,5/1341)，“末端缺失+末端重復(fù)”21例(1.6%,21/1341)，“多個缺失和(或)重復(fù)”26例(1.9%,26/1431)。67例大片段異常病例中，42例進(jìn)行了雙親溯源檢查，發(fā)現(xiàn)8例平衡易位：母系遺傳3例，包括t(8;16)(q22;q12)，t(11;17)(q21;q23)，t(2;8)(q32;q21.2)；父系遺傳5例，包括t(5;10;18)(q31;q23;q21)，t(11;15)(p15;q24)，t(4;10)(q35;q26)，t(1;6)(q42;p23)，t(13;20)(q12;p12)，其余均為新發(fā)變異。25例致病性微缺失/微重復(fù)中，檢出“末端微缺失/微重復(fù)”7例(0.5%,7/1341)，“中間微缺失/微重復(fù)”16例(1.2%,16/1341)，“多個微缺失和/微重復(fù)”2例(0.2%,2/1341)，其中15例行雙親溯源檢查，發(fā)現(xiàn)4例遺傳自雙親之一：3例(病例12、13和24)為母系遺傳，1例(病例17)為父系遺傳，其余11例為新發(fā)變異，見表2。本研究共檢出5個重復(fù)出現(xiàn)(n=2)的致病性微缺失/微重復(fù)(15q11.2、19p13.3、22q13.2q13.33微缺失和17p13.3、22q11.1q11.21微重復(fù))，見表3。

圖1 RM病例中不同染色體CNVs分布情況

表2 25例致病性微缺失/微重復(fù)CMA結(jié)果

表3 RM病例中復(fù)發(fā)性微缺失/微重復(fù)

2.5 年齡和流產(chǎn)次數(shù)與胚胎染色體異常的關(guān)系 年齡<35歲組、35～39歲組以及≥40歲組胚胎染色體異常檢出率分別為57.6%、70.7%和85.2%，35～39歲組以及≥40歲組胚胎染色體異常檢出率均明顯高于<35歲組(P<0.01)；母親年齡<35歲組、35～39歲組以及≥40歲組胚胎異倍體檢出率分別為39.8%、62.5%和75.4%，35～39歲組以及≥40歲組胚胎異倍體檢出率均明顯高于<35歲組(P<0.01)；多倍體、CNVs≥10Mb、CNVs<10Mb、UPD在不同年齡組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。不同類型胚胎染色體異常檢出率在母親年齡35～39歲組和≥40歲組間均無明顯差異。母親年齡與胚胎染色體異常的關(guān)系見表4。

表4 母親年齡與胚胎染色體異常的關(guān)系[n(%)]

孕婦流產(chǎn)2次、3次和≥4次組病例的胚胎染色體異常率分別為62.6%、56.5%和51.9%；矯正母親年齡后，流產(chǎn)2次組病例的染色體異常率顯著高于流產(chǎn)次數(shù)3次、≥4次組(P<0.05)。孕婦流產(chǎn)2次組異倍體檢出率顯著高于流產(chǎn)次數(shù)3次組(46.4% vs 38.8%,P<0.01)，而多倍體、CNVs≥10Mb、CNVs<10Mb、UPD在不同流產(chǎn)次數(shù)組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表5。

表5 自然流產(chǎn)次數(shù)與胚胎染色體異常的關(guān)系[n(%)]

3 討 論

本研究旨在探討CMA在RM遺傳學(xué)診斷中的應(yīng)用價值。本研究中RM病例的總體染色體異常檢出率為60.7%，與既往報道相符(50%～70%)[2,11]。本研究中最主要的染色體異常類型為異倍體，檢出率為44.5%，其次分別是多倍體(8.4%)、致病性大片段缺失/重復(fù)(≥10Mb)(5.0%)和致病性微缺失/微重復(fù)(<10Mb)(1.9%)。在異常染色體類型中占比最小的是UPD，檢出率為0.8%。本研究中RM胚胎不同類型染色體異常頻率與程丹等[15]研究報道相近。CMA技術(shù)檢測分辨率高、實(shí)驗(yàn)周期短、檢測成功率高、通量高，在RM病因?qū)W研究中具有重要臨床價值，能為再次生育提供完善、精準(zhǔn)的遺傳學(xué)信息。

染色體數(shù)目異常是RM最常見的原因，并以異倍體最多見。本次研究的異倍體和多倍體的頻率(44.5%和8.4%)與其他大規(guī)模研究報道(37.7%和8.2%)基本一致[16]。異倍體病例中，16號染色體三體最常見，占染色體數(shù)目異常的15.6%(111/710)。其余異倍體異常主要集中在X染色體單體和22號染色體三體，這與Pylyp等[17]報道基本一致。除19號染色體外，其余所有染色體都檢出了異倍體。目前普遍認(rèn)為，生殖細(xì)胞減數(shù)分裂長期停滯、暴露于環(huán)境污染物等情況下，卵母細(xì)胞易錯誤分離并將異倍體傳遞給下一代。異倍體的發(fā)生大多是因配子形成中偶發(fā)的分離錯誤，因此異倍體流產(chǎn)患者相比染色體正常流產(chǎn)患者預(yù)后更好[13]。三倍體是RM最常見的多倍體類型，檢出率為6.8%，超三倍體、亞三倍體、四倍體相對少見，檢出率分別為0.7%、0.6%和0.3%。當(dāng)出現(xiàn)雙雄受精、雙雌受精、核內(nèi)復(fù)制及核內(nèi)有絲分裂等異常配子情況時，就會導(dǎo)致多倍體的發(fā)生。此外，本研究還檢出11例全基因組UPD(0.8%)，與Finley等[18]研究(0.8%)一致。

染色體大片段結(jié)構(gòu)異常是RM的重要遺傳學(xué)病因[18]。本研究中致病性大片段結(jié)構(gòu)異常的檢出率為5.0%，高于Kowalczyk等[16]研究中的3.2%，可能與不同研究中RM定義不同有關(guān)。染色體“末端缺失+末端重復(fù)”通常提示胚胎存在染色體不平衡易位，考慮雙親之一可能是平衡易位攜帶者。本研究中67例大片段異常中，42例進(jìn)行了雙親溯源檢查，發(fā)現(xiàn)8例病例遺傳自雙親之一，其余均為新發(fā)變異。既往文獻(xiàn)報道，夫婦之一為平衡易位攜帶者，下一次妊娠流產(chǎn)的發(fā)生率為55.6%，活產(chǎn)率為42.9%[19]。為避免再次流產(chǎn)或生育染色體結(jié)構(gòu)異常患兒，建議平衡易位攜帶者夫婦下一次妊娠行胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(preimplantation genetic test,PGT)或自然受孕后孕中期行介入性產(chǎn)前診斷。RM病例行胚胎流產(chǎn)物CMA檢測可為再次妊娠提供精準(zhǔn)的風(fēng)險評估及遺傳咨詢。

RM與特定微缺失/微重復(fù)的相關(guān)性尚未明確。本研究中致病性微缺失/微重復(fù)的發(fā)生率為1.9%，略高于Zhu等[7]研究中的1.2%。25例致病性微缺失/微重復(fù)RM病例中，4例是遺傳性的(3例為母系遺傳，1例為父系遺傳)。Xp22.31微缺失(病例24)可導(dǎo)致X連鎖魚鱗病(X-linked ichthyosis,XLI)，與位于X染色體短臂的類固醇硫酸酯酶基因(STS)缺失、突變有關(guān)，通常出生后3個月內(nèi)開始發(fā)病，患者全身皮膚干燥、粗糙，覆蓋褐色鱗片。本病為X染色體連鎖隱性遺傳方式，幾乎全部見于男性，在男性新生兒中的發(fā)病率為1/2000～1/9500[20]，女性為攜帶者極少發(fā)病。XLI女性攜帶者的男性后代中有50%為患者，女性后代有50%為攜帶者。其余2例16號染色體微缺失(病例13，16p13.11微缺失；病例12，16p11.2微缺失)病例的母親表型均正常，考慮可能與不完全外顯有關(guān)[21]。16p13.11區(qū)段缺失可導(dǎo)致“16p13.11微缺失綜合征”，可引起神經(jīng)功能障礙如智力發(fā)育遲緩、自閉癥、多動癥、精神分裂癥、癲癇和學(xué)習(xí)困難，以及腦皮質(zhì)發(fā)育異常等臨床表型，該微缺失外顯率約為13.1%[21]。16p11.2區(qū)段缺失可導(dǎo)致末端型16p11.2微缺失綜合征(BP2-BP3)，包含關(guān)鍵基因(SH2B1,ATP2A1,CD19)，該綜合征常見的臨床表型包括智力低下、自閉癥、癲癇，以及少見的表型如肥胖、半椎體等，該微缺失的外顯率約62.4%[21]。對于攜帶不完全外顯的致病性CNVs的夫婦，考慮到盡管可以在孕中期進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷，但仍無法確定胎兒出生后是否外顯發(fā)病，通常建議攜帶者夫婦下次妊娠選擇PGT避免該CNVs的傳遞。值得關(guān)注的是，本研究還發(fā)現(xiàn)5個重復(fù)出現(xiàn)(n=2)的致病性微缺失/微重復(fù)(15q11.2、19p13.3、22q13.2q13.33微缺失和17p13.3、22q11.1q11.21微重復(fù))。既往多篇研究在RM病例中檢測發(fā)現(xiàn)了15q11.2、19p13.3微缺失和17p13.3、22q11.1q11.21微重復(fù)[12,22]。本研究進(jìn)一步表明以上微缺失微重復(fù)可能與RM相關(guān)。此外，本研究首次發(fā)現(xiàn)，22q13.2q13.33微缺失可能與RM相關(guān)。22q13區(qū)段(包含關(guān)鍵致病基因SHANK3)的微缺失可導(dǎo)致Phelan-McDermid綜合征，臨床表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、男性生殖器異常、肌張力低下、語言障礙、中度至重度智力低下、自閉癥等[23]，該微缺失導(dǎo)致RM的致病機(jī)制還需進(jìn)一步研究。上述微缺失/微重復(fù)與RM的相關(guān)性還需進(jìn)一步大規(guī)模研究以及功能實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，母親年齡≥35歲的胚胎染色體異常率明顯高于<35歲者(74.3% vs 57.6%,?偅iP<0.01)，染色體異常率在母親年齡35～39歲和≥40歲兩組間并無顯著差異。異倍體檢出率在<35歲組、35～39歲組和≥40歲組分別為57.6%、70.7%和85.2%，提示異倍體的發(fā)生隨著母親年齡增加而增加，這與高齡孕婦卵母細(xì)胞核心囊成分表達(dá)減少、線粒體功能障礙和重組失敗概率增加從而導(dǎo)致異倍體發(fā)生率增加有關(guān)[17]。然而RM病例中多倍體、CNVs≥10Mb、CNVs<10Mb、UPD的檢出率在不同年齡組中無顯著差異，這提示母體年齡可能并不是多倍體、CNVs≥10Mb、CNVs<10Mb、UPD這些異常類型的獨(dú)立危險因素，這與沈曄等[24]研究報道結(jié)果相符。

胚胎染色體異常率與流產(chǎn)次數(shù)的相關(guān)性目前存在爭議。Sheng等[12]認(rèn)為，胚胎染色體異常率與流產(chǎn)次數(shù)無明顯相關(guān)性。Ogasawara等[11]研究報道，胚胎染色體異常率隨既往流產(chǎn)次數(shù)的增加而減小。雖然既往流產(chǎn)次數(shù)分組不同和胚胎染色體異常的分類不同可能是導(dǎo)致結(jié)論不一致的原因，但是既往研究并未矯正母親年齡因素可能是主要因素。目前普遍認(rèn)為胚胎染色體異常率隨著母親年齡增加而增加[6,11]，母親年齡作為混雜因素降低結(jié)論可信度。本研究中，矯正母親年齡后，流產(chǎn)2次組病例的染色體異常率顯著高于流產(chǎn)次數(shù)3次和≥4次組。孕婦流產(chǎn)2次組異倍體檢出率顯著高于流產(chǎn)次數(shù)3次組，而多倍體、CNVs≥10Mb、CNVs<10Mb、UPD的發(fā)生率似乎與流產(chǎn)次數(shù)無關(guān)。綜上，本研究認(rèn)為，隨著既往流產(chǎn)次數(shù)增多，胚胎染色體異常率會降低，這可能與隨著流產(chǎn)次數(shù)增多，其他原因在RM中起到的作用逐漸增大，胚胎染色體隨機(jī)異常原因占比逐漸減小有關(guān)[11]。

綜上所述，CMA技術(shù)具有分辨率高、檢測周期短、成功率高和通量高等優(yōu)勢，對RM遺傳學(xué)病因的評估具有重要價值，能為再次生育提供精準(zhǔn)的風(fēng)險評估及妊娠方式選擇等遺傳咨詢。本研究發(fā)現(xiàn)5個RM相關(guān)的復(fù)發(fā)性致病性微缺失微重復(fù)，其中22q13.2q13.33微缺失是新發(fā)現(xiàn)的可能與RM相關(guān)的致病性微缺失，再次證實(shí)CNVs在RM的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，為RM的病因?qū)W研究提供了新的思路。