楊珊伊，陳鴻煒，周海琳，朱一帆，張嘉豪，王旋成，黃宗聲，張淇淞，2*

（1.廣西大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.湖北民族大學(xué) 風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000；3.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 南寧 530021）

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是世界3種最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一［1］。雖然腫瘤的治療技術(shù)在不斷發(fā)展，但CRC致死數(shù)仍占癌癥死亡總數(shù)的9.40%，是腫瘤致死的第二大原因。研究報(bào)道，CRC主要通過(guò)腺瘤－癌途徑發(fā)展而來(lái)，結(jié)直腸腺瘤（Colorectal adenoma，CA）是CRC的重要癌前病變，通常CA形成CRC完成整個(gè)癌變過(guò)程約需要10 ~ 15年時(shí)間［2－3］，該階段無(wú)特異性臨床癥狀，隱匿性較強(qiáng)，一旦發(fā)展為CRC，患者的治愈率和生存率將大大降低?；颊呷裟茉贑A階段獲得及時(shí)診斷和治療可明顯改善其生存率和治愈率，因此，CRC的早期篩查對(duì)于其預(yù)防與診療至關(guān)重要［4］。

由于CA發(fā)展的隱匿性，其通常難以被發(fā)現(xiàn)從而導(dǎo)致診斷延遲或漏診等問(wèn)題，最終導(dǎo)致CRC的治療和預(yù)后效果不理想［5］。目前，傳統(tǒng)的結(jié)直腸鏡檢查是診斷CRC的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，結(jié)直腸鏡檢查屬于侵入性檢查，易導(dǎo)致患者的耐受性差，以及穿孔和出血等并發(fā)癥的發(fā)生［6］。其他非侵入性方法，如無(wú)創(chuàng)定量糞便免疫化學(xué)檢測(cè)可用于CRC早期無(wú)創(chuàng)篩查［7］，但敏感性和特異性不佳。因此，急需尋找一種安全、微創(chuàng)且高效的生物標(biāo)志物用于CRC的早期診斷和篩查。

相較傳統(tǒng)的結(jié)直腸鏡檢查，基于微創(chuàng)或非侵入性生物標(biāo)志物的診斷檢測(cè)具有明顯優(yōu)勢(shì)［8－9］。其中高通量組學(xué)技術(shù)（代謝組學(xué)與脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)等）被視為疾病診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的重要前沿技術(shù)［10］。代謝組學(xué)技術(shù)可以檢測(cè)到生物代謝途徑的細(xì)微差別，有助于進(jìn)一步揭示機(jī)體生理或病理變化的潛在機(jī)制。盡管代謝組學(xué)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多個(gè)研究領(lǐng)域，包括癌癥等多種疾病的診療研究［11］，但其在CA和CRC患者判別生物標(biāo)志物的相關(guān)研究尚無(wú)報(bào)道。研究表明，系統(tǒng)性生物流體中代謝譜的變化主要反映宿主對(duì)炎癥或腫瘤等病理變化的反應(yīng)［12］，其中血清代謝物水平的變化可直接反映機(jī)體內(nèi)源性代謝變化和病理改變，同時(shí)激活的免疫反應(yīng)會(huì)影響血液中代謝物的種類或豐度，從而有助于及早發(fā)現(xiàn)機(jī)體的代謝失調(diào)和病變。目前，通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)的診斷標(biāo)志物包括甘油三酯、磷脂酰甘油、5-羥色胺等，對(duì)于CRC的臨床診療評(píng)估有重要作用［13］。但是目前尚缺乏可用于CRC早期診斷的微創(chuàng)生物標(biāo)志物，因此，臨床上迫切需要發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物來(lái)輔助CRC的早期診斷和預(yù)防，以降低CRC的發(fā)病率與死亡率。

本研究利用高靈敏度和高分辨率的超高效液相色譜－串聯(lián)高分辨質(zhì)譜（UHPLC－HRMS）技術(shù)對(duì)CA及CRC患者進(jìn)行血清非靶向代謝組學(xué)研究，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)CA與CRC患者的血清代謝輪廓差異，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行差異代謝物的篩選和評(píng)價(jià)，進(jìn)而獲得對(duì)CA和CRC患者具有良好判別效能的生物標(biāo)志物，以輔助CRC的早期診斷，從而針對(duì)性地延緩或阻止CA的癌變過(guò)程。同時(shí)，基于富集和通路分析的主要紊亂代謝通路的發(fā)現(xiàn)也為揭示CA惡性轉(zhuǎn)化的潛在代謝機(jī)制提供了支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UHPLC－HRMS儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司）；密理博超純水系統(tǒng)（美國(guó)密理博公司）；渦旋器（上海精科儀器有限公司）；超聲儀（上海生析超聲儀器有限公司）；制冰機(jī)（意大利Scotsman公司）；甲醇、二氯甲烷、異丙醇、乙腈、甲酸銨、甲酸均為色譜純（美國(guó)默克公司）。

1.2 樣本來(lái)源與制備

本研究方案通過(guò)廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：KY－DZX－202008），收集的所有血清樣本和受試者信息均征求受試者的書(shū)面同意，并簽署知情同意書(shū)，共納入64例CA患者和84例CRC患者。所有受試者術(shù)前禁食8 h，之后將血清樣品收集于凝血管中，以5 000 r/min在4 ℃下離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管中并于?80 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。將預(yù)冷的乙腈（200 mL）添加至50 mL血清中，渦旋3 min后在4 ℃下以13 000 r/min離心10 min，吸取全部上清液并進(jìn)行真空干燥。最后用100μL 75%乙腈水溶液（含0.5 μmol/L D4-脫氧膽酸和他莫昔芬）復(fù)溶，渦旋3 min后于4 ℃下以13 000 r/min離心20 min，收集全部上清液用于代謝組學(xué)分析。每個(gè)樣品取5 μL混合作為質(zhì)量控制（QC）樣品。在樣品分析前，通過(guò)平衡分析系統(tǒng)與至少6份空白樣品和6份QC樣品驗(yàn)證分析系統(tǒng)和方法的重復(fù)性與穩(wěn)定性［14］。

1.3 液相色譜與質(zhì)譜條件

液相色譜條件：Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：正離子模式為0.1%甲酸乙腈（A）?0.1%甲酸水（B），負(fù)離子模式為0.01%甲酸乙腈（A）?0.01%甲酸水（B）。洗脫程序均為：0.0 ~ 2.0 min，2% A；2.0 ~ 13 min，2% ~ 100% A；13 ~ 18 min，100% A；18 ~ 20 min，100% ~ 2% A。柱溫為40 ℃，流速為0.4 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），輔助氣流速為10 μL/min，鞘氣流速為40 μL/min，離子傳輸管溫度為320 ℃，霧化溫度為400 ℃，噴霧電壓為3.50 kV（正離子）或2.80 kV（負(fù)離子）；數(shù)據(jù)采集模式為Full Scan + ddMS2，一級(jí)掃描范圍為m/z100 ~ 1 200，一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜的質(zhì)量分辨率分別為70 000和17 500。

1.4 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理與分析

將代謝組學(xué)原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入數(shù)據(jù)處理軟件Compound Discovery 3.2中，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行峰對(duì)齊和歸一化處理，然后提取獲得含質(zhì)荷比、保留時(shí)間和峰強(qiáng)度的三維數(shù)據(jù)文件。通過(guò)SIMCA－P14.0軟件對(duì)代謝組學(xué)的三維數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS－DA），并采用200次置換檢驗(yàn)進(jìn)一步考察分析模型的可靠性和適用性，避免過(guò)擬合。由于機(jī)體內(nèi)源性的代謝水平易受到外界因素影響，因此，為減少組間差異代謝物的假陽(yáng)性率，并根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和課題組的前期研究，以變量重要性投影（VIP）> 1.00，倍數(shù)變化> 1.50或< 0.67且P< 0.05作為標(biāo)準(zhǔn)篩選組間差異代謝物［14－15］。隨后，根據(jù)精確分子量以及離子碎裂信息，利用儀器自帶數(shù)據(jù)庫(kù)（mzCloud及mzValut）和HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)組間差異代謝物進(jìn)行初步鑒定。最后，利用MetaboAnalyst軟件對(duì)差異代謝物進(jìn)行富集分析和通路分析，通過(guò)受試者工作特征曲線（ROC）分析對(duì)差異代謝物進(jìn)行判別效能評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與討論

2.1 主成分分析

將CA組、CRC組和QC組樣本在正、負(fù)離子模式下建立PCA模型進(jìn)行分析，考察儀器系統(tǒng)和檢測(cè)方法的穩(wěn)定性及樣本的分布趨勢(shì)。由圖1A和1B可知，QC組樣本在2種ESI模式下的聚集情況良好，說(shuō)明儀器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，可滿足代謝組學(xué)的分析要求。其中，CA組和CRC組的區(qū)分較為明顯，說(shuō)明兩組的血清代謝譜存在差異。與ESI?模式相比，在ESI+模式下，CA和CRC組的樣本簇之間分離趨勢(shì)更明顯。兩組中大部分的樣本點(diǎn)均在95%的置信區(qū)間內(nèi)，只有少數(shù)CRC組的樣本點(diǎn)分布在區(qū)間外，可能是由于存在較大的個(gè)體差異。此外，兩組的部分樣本點(diǎn)存在重疊，說(shuō)明CA與CRC組間有一定的相似性，兩者的鑒別存在一定難度。

2.2 正交偏最小二乘判別分析

為進(jìn)一步探究CA組與CRC組之間的代謝輪廓差異，基于PCA分析所涉及的代謝特征進(jìn)行OPLSDA分析，以篩選組間差異代謝物。與PCA分析的三維得分圖（圖1A、1B）相比，OPLS－DA分析的三維得分圖（圖1C、1D）中CA與CRC組的組間區(qū)分更顯著，能更直觀地表明兩者血清代謝譜的差異。在OPLS－DA模型中，正離子模式下的R2X、R2Y、Q2值分別為0.358、0.935、0.760，負(fù)離子模式下分別為0.192、0.973、0.767，說(shuō)明該模型表現(xiàn)出良好的數(shù)據(jù)解釋和預(yù)測(cè)能力。隨后，采用200次置換檢驗(yàn)進(jìn)一步考察該模型的可靠性與合理性。如圖1E和1F所示，正離子模式下的置換檢驗(yàn)主要評(píng)價(jià)參數(shù)R2Y、Q2、P值分別為0.944、?0.261和0.000，負(fù)離子模式下分別為0.685、?0.358和0.000，且兩者的直線初始點(diǎn)均高于樣品點(diǎn)，提示該模型不存在過(guò)擬合，數(shù)據(jù)分析合理。

圖1 CA與CRC組血清代謝組學(xué)的多元統(tǒng)計(jì)分析Fig.1 Multivariate statistical analysis for the serum metabolomics of CA and CRC patients PCA score plots in ESI+（A） and ESI?（B） modes，respectively；OPLS－DA score plots in ESI+（C） and ESI?（D） modes，respectively；OPLS－DA corresponding permutation tests in ESI+（E） and ESI?（F） modes，respectively

2.3 差異代謝物的篩選及其判別效能評(píng)價(jià)

根據(jù)兩組間的倍數(shù)變化和差異分析統(tǒng)計(jì)值，以倍數(shù)變化> 1.50或< 0.67，且P< 0.05為標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合VIP > 1.00篩選組間的差異代謝物，共確定66種差異代謝物。其中，甘油磷脂、脂肪酸、鞘磷脂、類固醇、氨基酸、膽堿、核苷的數(shù)量構(gòu)成比例分別為40.91%、28.79%、10.61%、7.58%、7.57%、1.51%、3.03%（圖2）。甘油磷脂和脂肪酸的占比最大，總構(gòu)成比高達(dá)69.70%，表明兩者所涉及的代謝紊亂可能與CA惡性轉(zhuǎn)變?yōu)镃RC有關(guān)。

圖2 不同類別組間差異代謝物的構(gòu)成分布Fig.2 Component distribution of differential metabolites between CA and CRC groups

同時(shí)，采用ROC分析評(píng)估上述66種差異代謝物對(duì)CA和CRC的辨別能力，計(jì)算AUC值后選擇最合適的截止點(diǎn)，優(yōu)化每種差異代謝物的靈敏度和特異性。在ROC分析前，對(duì)代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行QC歸一化處理，以有效降低個(gè)體差異和系統(tǒng)誤差的影響。通過(guò)差異代謝物的AUC值評(píng)估其作為生物標(biāo)志物對(duì)CA與CRC的判別效能，共確定11種對(duì)CA與CRC具有良好鑒別能力的差異代謝物作為潛在的生物標(biāo)志物（AUC > 0.800）。其中，ESI+模式下有7種代謝物，ESI?模式下有4種代謝物。腺嘌呤的AUC值高達(dá)0.952，而乙酰肉堿20∶1（ACar 20∶1）的AUC值為0.801?；赗OC分析，進(jìn)一步探討這些潛在生物標(biāo)志物在組間的水平變化趨勢(shì)。如表1所示，與CA組相比，其中10種差異代謝物在CRC組血清中均呈顯著上調(diào)趨勢(shì)，大部分為甘油磷脂與脂肪酸類代謝物，說(shuō)明甘油磷脂和脂肪酸的代謝水平上調(diào)可能參與CA的癌變過(guò)程。最后根據(jù)精確分子量和碎裂離子信息，利用儀器自帶數(shù)據(jù)庫(kù)和HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述11種差異代謝物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步鑒定，結(jié)果顯示匹配效果良好（圖3）。

圖3 高判別效能差異代謝物的鑒定效果Fig.3 Identification effect of differential metabolites with high discriminant ability for the CA and CRC patients

表1 CA與CRC患者的血清生物標(biāo)志物Table 1 Serum biomarkers for the discrimination between CA and CRC patients

2.4 差異代謝物的多元ROC分析及代謝通路分析

根據(jù)MetaboAnalyst 5.0軟件，采用基于支持向量機(jī)（SVM）算法的多元ROC分析自動(dòng)選擇最佳代謝物組合。如圖4所示，11種組間差異代謝物是主要的選擇與考察變量，利用多元ROC分析的AUC值評(píng)價(jià)其在區(qū)分CA和CRC方面的判別效能。圖4B為由圖4A中的前2、3、5、7、10和11種差異代謝物構(gòu)建的分類模型的ROC曲線及其AUC值。結(jié)果顯示，最佳的潛在生物標(biāo)志物是由前5種差異代謝物組成的標(biāo)志物組合（AUC = 0.941，95% CI = 0.901 ~ 0.987），其AUC值大于大部分單個(gè)差異代謝物的AUC值（圖4B）。因此，前5種差異代謝物的組合可作為CA癌變成CRC的潛在判別標(biāo)志物。

使用MetaboAnalyst 5.0對(duì)上述鑒定的66種差異代謝物進(jìn)行代謝物富集分析及通路分析，以初步探索與CA癌變相關(guān)的代謝通路機(jī)制。富集分析結(jié)果如圖4C所示，根據(jù)P< 0.05篩選出不飽和脂肪酸的生物合成、亞油酸代謝、嘌呤代謝途徑是影響CA惡變?yōu)镃RC的關(guān)鍵代謝途徑。通路分析結(jié)果如圖4D所示，以影響因子（IF） > 0.1或P< 0.05為標(biāo)準(zhǔn)確定與CA惡性轉(zhuǎn)化關(guān)聯(lián)緊密的代謝通路，可以明顯看出不飽和脂肪酸的生物合成、嘌呤代謝和亞油酸代謝是影響CA癌變轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵代謝通路。綜合代謝物富集與通路分析結(jié)果可得，上述3條代謝通路的紊亂可能與CA惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。

圖4 差異代謝物的多元ROC 分析與代謝通路分析Fig.4 Multivariate ROC analysis and metabolic pathway analysis by differential metabolites between CA and CRC groups

2.5 討 論

近年來(lái)，大部分研究致力于探索CRC的潛在診斷生物標(biāo)志物，但目前尚無(wú)通過(guò)血清代謝組學(xué)研究用于判別CA與CRC患者以輔助CRC早期診斷的可靠生物標(biāo)志物［15］。Gumpenberger等［16］通過(guò)血漿代謝

組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在CA和CRC之間有48種差異代謝物，主要包括溶血磷脂酰膽堿和磷脂酰膽堿。在本研究中，磷脂酰膽堿同樣被鑒定為主要的差異代謝物，其在兩組差異代謝物中數(shù)量占比最大，同時(shí)在多元ROC分析中的判別性能最高的代謝物組合中包括3種磷脂酰膽堿（PC36∶3、PC18∶0、PC20∶4）。除了磷脂酰膽堿外，本研究還發(fā)現(xiàn)脂肪酸也是區(qū)分CRC與CA的重要潛在生物標(biāo)志物。通常來(lái)說(shuō)，癌細(xì)胞中高表達(dá)脂肪酸，以滿足其快速增殖對(duì)上調(diào)合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞膜形成所需的能量需求。Zhou等［17］的血清脂質(zhì)組學(xué)研究中，4種脂肪酸（棕櫚酸、二十二碳六烯酸、4-十二烷基苯磺酸、15Z-9，12，13-三羥基-15-十八碳烯酸）也被確定為對(duì)CA具有良好診斷性能（AUC > 0.80）的潛在脂質(zhì)標(biāo)志物。

一般情況下，CA轉(zhuǎn)化為CRC的過(guò)程通常受到多條代謝通路的影響。Mokhtari等［18］對(duì)不飽和脂肪酸的生物合成與CRC進(jìn)展相關(guān)的機(jī)制進(jìn)行了研究，與正常組相比，CRC組中基于GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析的不飽和脂肪酸生物合成途徑的基因數(shù)量顯著增加，包括ELOVL5、TECR、HSD17B112和FADS2基因等，表明了不飽和脂肪酸代謝與CRC發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。同樣，本研究也發(fā)現(xiàn)相較于CA組，CRC中的脂肪酸含量明顯增加，且通過(guò)代謝物通路及富集分析發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸代謝通路的失調(diào)與CA的癌變密切相關(guān)。此外，有研究分析了CRC大鼠模型的糞便和血漿樣本，發(fā)現(xiàn)相較于正常組，CRC組樣本中的亞油酸含量顯著升高，表明亞油酸代謝的紊亂是CRC大鼠模型的重要代謝特征［19］。相似地，本文的研究結(jié)果也顯示亞油酸水平在CRC階段顯著增加，表明亞油酸代謝的上調(diào)對(duì)腺瘤－癌途徑的發(fā)展進(jìn)程有促進(jìn)作用。腫瘤細(xì)胞不受控制的無(wú)限增殖是癌癥形成的主要標(biāo)志，而腫瘤細(xì)胞中嘌呤代謝物呈現(xiàn)顯著上調(diào)，嘌呤通過(guò)各種受體亞型在細(xì)胞免疫反應(yīng)和細(xì)胞因子釋放中充當(dāng)有效的調(diào)節(jié)劑，在很大程度上參與腫瘤的產(chǎn)生［20］。本研究也發(fā)現(xiàn)嘌呤代謝紊亂與CA的惡化密切相關(guān)，且腺嘌呤對(duì)CA和CRC具有最高的判別效能而作為潛在生物標(biāo)志物。然而，上述論證聚焦于通過(guò)對(duì)CRC組與正常組的比較來(lái)探討影響癌癥產(chǎn)生的代謝機(jī)制，在本研究中，基于CA與CRC患者血清差異代謝物的富集和通路分析發(fā)現(xiàn)，不飽和脂肪酸、嘌呤代謝以及亞油酸代謝通路的紊亂不僅如文獻(xiàn)報(bào)道所述與CRC的發(fā)生有關(guān)，同時(shí)也與CA癌變的潛在機(jī)制有關(guān)。

綜上所述，本研究系統(tǒng)揭示了CA與CRC的血清代謝譜差異，發(fā)現(xiàn)11種差異代謝物對(duì)兩組患者表現(xiàn)出良好的鑒別效能，可作為潛在生物標(biāo)志物。特別是其中5種差異代謝物（PC36∶3、腺嘌呤、鞘氨醇、PC18∶0、PC20∶4）組成的代謝物組合可以作為鑒別CA與CRC的潛在生物標(biāo)志物。此外，還發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸的生物合成、嘌呤代謝和亞油酸代謝的紊亂可能與CA惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示結(jié)直腸腺瘤－癌途徑在CRC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的潛在作用機(jī)制提供了參考。

3 結(jié) 論

CRC的早期篩查與治療是降低其發(fā)病率和死亡率的有效途徑，代謝組學(xué)技術(shù)在腫瘤早期篩查中表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。本文利用高通量和高靈敏度的UHPLC－HRMS技術(shù)對(duì)CA與CRC患者的血清樣本進(jìn)行代謝組學(xué)分析，系統(tǒng)揭示了兩者的代謝輪廓存在明顯差異，其中，甘油磷脂和脂肪酸是主要差異代謝物，表明其代謝紊亂可能參與CA的癌變過(guò)程。此外，5種差異代謝物的組合（包括PC36∶3、腺嘌呤、鞘氨醇、PC18∶0、PC20∶4）在區(qū)分CA和CRC方面表現(xiàn)了出色的判別效能，可作為潛在的判別標(biāo)志物。總體上，本研究為深入研究CA與CRC的血清代謝特征差異以及CA的癌變代謝機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)也對(duì)兩者的臨床鑒別和CRC的早期診斷具有較高的參考意義。由于臨床樣本和動(dòng)物模型的限制，本研究的相關(guān)發(fā)現(xiàn)仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。