孔德明，陳 超，周啟動，劉則華，郭鵬然*

（1.廣東省科學院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心），廣東省化學測量與應急檢測重點實驗室，廣東 廣州 510070；2.華南理工大學 環(huán)境與能源學院，廣東 廣州 510006）

環(huán)境內分泌干擾物因可能對人體健康造成危害成為關注的焦點［1－2］。根據(jù)產(chǎn)生途徑，環(huán)境內分泌干擾物主要包括天然雌激素、雄激素、植物雌激素、霉菌類雌激素，以及各種工業(yè)化學物質［1］，其中外源性攝入的天然雌激素因同樣具有較強的雌激素生物活性而受到重視。牛奶由于其營養(yǎng)價值豐富且容易消化吸收而廣泛出現(xiàn)在世界各國人的食譜中［3－4］，然而牛奶也是人體外源性天然雌激素的重要攝入來源［5－6］，據(jù)聯(lián)合國糧農組織統(tǒng)計，全球每年牛奶的消費量將近7×108噸［7］，因此人體通過牛奶攝入天然雌激素的風險絕對不容忽視。目前牛奶中天然雌激素的研究通常是針對4種常見天然雌激素［8］，即雌酮（E1）、17α-雌二醇（17α-E2）、17β-雌二醇（E2）和雌三醇（E3），而其它天然雌激素的研究鮮有報道［3，5，8－11］。

目前國內外牛奶中雌激素的檢測方法主要有免疫檢測法和質譜法［1，12］。免疫檢測法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）［6，9］和放射性免疫測定（RIA）［13］，質譜法則主要采用液液萃取［8，14－15］、固相萃?。?0，16－21］、磁性固相萃?。?2－23］和固相微萃?。?4－25］等前處理技術，結合氣相色譜－三重四極桿質譜（GC－MS/MS）［16］和液相色譜－三重四極桿質譜（LC－MS/MS）［21］進行檢測。Malekinejad等［8］利用液液萃取結合LC－MS/MS測定牛奶中的天然雌激素，在僅考察4種常見天然雌激素（E1、E2、E3、17α-E2）情況下，評估出人體通過牛奶攝入的天然雌激素每人每天平均可達372 ng，可見牛奶是人體外源性天然雌激素的主要暴露來源之一。研究還發(fā)現(xiàn)，天然雌激素E1、E2可代謝轉化為16α-羥基雌酮（16αOHE1）和16keto雌二醇（16ketoE2），其中16ketoE2的雌激素效應與最高的E2相當［26－29］。為更全面評估牛奶的安全性，本研究建立了一種GC－MS同時測定牛奶樣品中E1、E2、17α-E2、E3、16αOHE1、16ketoE2 6種天然雌激素的方法，并將其應用于實際樣品的測定，滿足了牛奶中天然雌激素的檢測和質量控制需求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7890A/5975C氣相色譜－串聯(lián)質譜儀（美國安捷倫公司）；BSA224S－CW電子分析天平（德國賽多利斯）；TDL－40B離心機（上海安亭科學儀器廠）；BF－2000F氮吹儀（北京八方世紀科技有限公司）；Vortex－2渦旋儀（上海滬析實業(yè)有限公司）；P100N移液器（法國Eppendorf公司）；24位型負壓固相萃取裝置（深圳逗點生物技術有限公司）；DHG－9075A恒溫干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；OASIS HLB Cartridge固相萃取柱（225 mg，美國Waters公司）。

標準物質：E1、E2、17α-E2、E3、16αOHE1、16ketoE2（純度均大于98%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）；內標：17β-E2-D4（E2-D4，純度大于98%，天津阿爾塔科技有限公司）；雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA） + 1% 三甲基氯硅烷（TMCS，Regis Technologies）；N，N-二甲基甲酰胺（DMF，上海安普科技股份有限公司）；乙酸乙酯、乙腈、甲醇（色譜級，Sigma公司）；磷酸氫二鉀（分析純，廣州化學試劑廠）；牛奶（超高溫瞬時滅菌牛奶，保質期內）購于廣州當?shù)氐某?，?20 ℃保存。實驗用水均為超純水。

1.2 標準溶液的配制

雌激素混合標準儲備液：準確稱取10 mg的6種雌激素標準品于10 mL容量瓶中，甲醇定容，配制成1 g/L的標準儲備液，于?20 ℃保存。

中間標準溶液：用甲醇將上述標準儲備液稀釋成1 μg/mL的中間標準溶液，于?20 ℃保存。

標準工作液：6種雌激素的質量濃度梯度為5、10、20、40、80、100 μg/L；其中均加入50 ng的17β-E2-D4內標，定容至1 mL。

1.3 樣品前處理

提?。毫咳?0 mL牛奶樣品于50 mL離心管中，加入50 ng內標，10 mL乙腈萃取振蕩15 min后，加入6 g磷酸氫二鉀粉末，依次渦旋1 min，4 000 r/min離心10 min后，收集上清液。

富集凈化：將上清液轉移至500 mL燒杯中，用水稀釋至500 mL；固相萃取柱經(jīng)過5 mL乙酸乙酯、5 mL甲醇、10 mL水活化后，將上述稀釋的上清液在流速10 mL/min下通過固相萃取柱富集；然后依次用5 mL 10%甲醇、5 mL水、5 mL甲醇－水－氨水（10∶88∶2，體積比）清洗凈化；負壓下抽干固相萃取柱后，依次使用8 mL甲醇－乙酸乙酯（8∶2）和2 mL乙酸乙酯洗脫目標物。

衍生化：收集洗脫液，氮吹至干后，加入100 μL DMF復溶，加入100 μL BSTFA + 1% TMCS衍生化試劑80 ℃下反應60 min后［28］，用乙酸乙酯定容至1 mL，待上機測定。

1.4 色譜－質譜條件

安捷倫HP－5MS色譜柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；升溫程序：初始溫度為100 ℃，10 ℃/min升至200 ℃，8 ℃/min升至260 ℃，3 ℃/min升至300 ℃，并保持2 min；進樣量：3 μL；進樣口溫度：280 ℃；輔助加熱區(qū)：280 ℃；載氣：氦氣（純度 > 99.999%）；恒流模式；進樣方式：不分流進樣；流速：0.85 mL/min。

離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；檢測方式：選擇離子模式（SIM）；電離能量：70 eV；其他參數(shù)見表1。

表1 6種天然雌激素的分析參數(shù)Table 1 Analytical parameters of six natural estrogen compounds

2 結果與討論

2.1 色譜－質譜條件的優(yōu)化

由于雌激素類物質的衍生物極性弱，因此實驗采用固定相為5%苯基－甲基聚硅氧烷的弱極性石英毛細管柱進行分離。采用200 μg/L混合標準溶液考察了色譜條件。在優(yōu)化后色譜條件（見“1.4”）下，目標峰與其它干擾峰完全分開，滿足定性定量要求。為了提高分析靈敏度，實驗采用選擇離子（SIM）模式，選擇3個特征離子，其中1個定量離子，2個定性離子（見表1）。

2.2 提取溶劑的選擇

根據(jù)6種雌激素在弱極性或中等極性的有機溶劑中有較高的溶解性，考察了甲醇、乙酸乙酯、乙腈和含20%乙酸乙酯的乙腈4種提取溶劑對6種待測物的加標回收率（見圖1）。結果顯示，采用甲醇提取時，加標回收率最低；采用乙酸乙酯和含20%乙酸乙酯的乙腈提取時，乙酸乙酯帶入了更多的非極性脂質類物質，提高了基質效應，導致整體回收率偏高。因此實驗選擇乙腈作為最佳提取溶劑。

圖1 提取溶劑對牛奶中6種雌激素提取效率的影響（n = 3）Fig.1 Effect of extraction solvent on extraction recoveries of six estrogens from milk（n = 3）

2.3 提取溶劑體積的優(yōu)化

以乙腈為提取溶劑，考察了5、10、15、20 mL不同提取溶劑體積對目標物提取效率的影響。結果顯示，選用10 mL提取溶劑時6種目標物均有較好的回收率（圖2）。當提取溶劑體積降低為5 mL時，樣品與提取溶劑的接觸面減少，從而影響兩相傳質效果，導致提取效率偏低；當提取溶劑增加為15、20 mL時，由于兩相濃度分配早已達平衡等原因，提取效率未進一步提升?？紤]試劑消耗，選擇提取溶劑的最佳體積為10 mL。

圖2 提取溶劑體積對牛奶中6種雌激素提取效率的影響（n = 3）Fig.2 Effect of extraction volume on extraction recoveries of six estrogens from milk（n = 3）

2.4 線性范圍、檢出限與定量下限

采用本方法測定“1.2”中配制6種目標化合物的標準工作溶液，內標法定量。結果表明（表2），6種雌激素在5 ~ 100 μg/L質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數(shù)（r2）大于0.995。采用空白牛奶樣品中添加目標物的方法，以3倍信噪比（S/N）對應的質量濃度為方法檢出限（LOD），10倍信噪比（S/N）對應的質量濃度為方法定量下限（LOQ），方法檢出限和定量下限分別為0.17 ~ 0.51 μg/L和0.56 ~ 1.68 μg/L。

表2 6種天然雌激素的線性方程、線性范圍、檢出限及定量下限Table 2 Linear equations，correlation coefficients（r2），LODs and LOQs of six estrogen compounds

2.5 回收率與相對標準偏差

為驗證方法的準確性和重復性，分別在牛奶樣品中加入低、中、高4個不同質量濃度水平（5、10、20、50 μg/L）的標準溶液及內標，按照“1.3”進行樣品前處理，每個濃度水平設置9個樣品，計算每個樣品的回收率和相對標準偏差（RSD）。由表3可知，在4個加標水平中，6種目標物的回收率為83.1% ~ 119%，RSD為2.1% ~ 15%，表明該方法的準確性和精密度符合方法學要求。

表3 6種天然雌激素的回收率及相對標準偏差（n = 9）Table 3 Spiked recoveries and relative deviations of six natural estrogen compounds（n = 9）

2.6 實際樣品的測定

采用本方法對市場上銷售的3款牛奶進行測定（表4）。檢測結果顯示，除了E3，其他5種雌激素均能在牛奶中檢出，其中E1的檢出量為0.91 ~0.99 μg/L；16αOHE1的檢出量為0.22 ~ 0.29 μg/L；17α-E2僅在1號樣中檢出，檢出量為0.20 μg/L；E2檢出量為3.27 ~ 3.33 μg/L；16ketoE2在3個樣品中均檢出，檢出量為0.38 ~ 2.16 μg/L，陽性樣品的檢測譜圖如圖3所示。

圖3 陽性樣品中5種雌激素的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of five estrogens in positive samples

表4 牛奶中6種天然雌激素的檢測結果Table 4 Detection results of six natural estrogens in milk ρ/（μg·L?1）

3 結 論

本研究成功建立了氣相色譜－串聯(lián)質譜同時測定牛奶中6種天然雌激素的方法。該方法具有靈敏度高、精密度好的優(yōu)點，適合用于牛奶及其制品中天然雌激素含量的測定，可為牛奶質量控制提供參考。