林永健，徐敦明，沈鷺英，劉正才，李雨哲，王 偉，肖 晶

（1.福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.廈門海關(guān)技術(shù)中心，福建 廈門 361026；3.福州海關(guān)技術(shù)中心，福建 福州 350001；4.國家食品安全風(fēng)險評估中心，北京 100022）

尼卡巴嗪是一種于1955年合成的抗球蟲藥，為4，4′-二硝基均二脲（4，4′-Dinitrocarbanilide，DNC）和2-羥基-4，6二甲嘧啶（2-Hydroxy-4，6-dimethyl-pyrimidine，HDP）的復(fù)合物，由于性能優(yōu)良、高效，至今仍是肉雞生產(chǎn)商在肉雞飼料中使用的最有效產(chǎn)品之一［1－2］。HDP具有親水性，在動物體內(nèi)會隨著尿液排出，代謝迅速；而DNC的水溶性小于0.02 mg·L?1，需通過糞便排出，代謝緩慢［3］，不能完全代謝排出體外，因而會殘留在肌肉及其他組織中，人們食用該食物后會產(chǎn)生潛在危害［4］。因消費者更容易接觸到DNC，歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）建議以DNC單體作為尼卡巴嗪的殘留標(biāo)識物［5］。許多國家和地區(qū)對雞肉中尼卡巴嗪的最高殘留限量（Maximum residue limit，MRL）進(jìn)行了規(guī)定，我國規(guī)定雞組織中尼卡巴嗪的MRL為200 μg·kg?1，國際食品法典委員會規(guī)定雞組織中其MRL為200 μg·kg?1，美國和歐盟規(guī)定雞組織中其MRL為4 000 μg·kg?1［6－8］。

標(biāo)準(zhǔn)樣品（RM）是一種性質(zhì)均勻且穩(wěn)定，具有一種或多種特性值可滿足測量使用的材料，可用于校準(zhǔn)設(shè)備、評價測量方法或給材料賦值［9］?；w標(biāo)準(zhǔn)樣品是具有實際樣品特性的標(biāo)準(zhǔn)樣品，由目標(biāo)基體與目標(biāo)化合物相結(jié)合，與實際檢測樣品更為一致，在分析中可有效避免基體效應(yīng)對目標(biāo)成分分析的影響［10］。標(biāo)準(zhǔn)樣品作為實物標(biāo)準(zhǔn)，與相關(guān)國家文本標(biāo)準(zhǔn)配合使用，能有效實施國家文本標(biāo)準(zhǔn)，提高測量的準(zhǔn)確性和產(chǎn)品質(zhì)量。為滿足相關(guān)檢測的需要，開展相關(guān)基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制工作十分必要［11］。近年來各國對食品安全檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品高度重視，尤其是與實際檢測樣品相接近的基體標(biāo)準(zhǔn)樣品［12］。我國的文本標(biāo)準(zhǔn)相對完善，但實物標(biāo)準(zhǔn)的種類和數(shù)量尚不能滿足需求。目前，以雞肉為基體已成功研制了妥曲珠利及妥曲珠利砜、金剛烷胺和利巴韋林、硝基呋喃類等獸藥殘留基體標(biāo)準(zhǔn)樣品［13－15］。通過查詢國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)樣品信息數(shù)據(jù)庫，未見與尼卡巴嗪相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)樣品。為填補我國尼卡巴嗪藥物殘留基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的空白，本文從動物喂藥到結(jié)果定值進(jìn)行探討，研制出含尼卡巴嗪的雞肉基體標(biāo)準(zhǔn)樣品。該方法操作簡單、穩(wěn)定可靠，可為后續(xù)開展獸藥殘留基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制工作提供參考。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

實驗用白羽肉雞由福建圣農(nóng)發(fā)展股份有限公司提供，體質(zhì)量約1 kg；實驗用藥為市售尼卡巴嗪原藥粉（含量≥ 98%，山東魯西獸藥股份有限公司）。

乙腈、甲醇、正己烷（均為色譜純，德國Merck公司）；無水硫酸鈉、二甲基甲酰胺、乙酸銨（均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；尼卡巴嗪標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥ 98.5%）購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；同位素內(nèi)標(biāo)尼卡巴嗪－D8（純度≥ 99.0%）購自德國Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

API 6500液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Applied Biosystems公司）；高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；YQ－6電動肉丸機（佛山俊凌廚具電器廠）；Stomacher 3500型拍擊均質(zhì)器（英國Seward公司）；分析天平（上海衡際公司）；渦旋振蕩器（德國IKA公司）；60Co－γ－射線輻照裝置（福建省康普頓公司）。

1.3 尼卡巴嗪陽性樣品的制備

為獲得預(yù)期濃度的尼卡巴嗪自然代謝雞肉樣品，需通過預(yù)實驗獲得最佳制備條件。由于肉糜的均勻性和穩(wěn)定性不足，需將雞肉樣品制成凍干粉，利用輻照滅菌有效降低微生物對樣品穩(wěn)定性的影響。

樣品制備的流程如圖1所示。按每1 kg飼料混合0.15 g尼卡巴嗪，對實驗白羽雞進(jìn)行飼料口服喂藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥3天。尼卡巴嗪在雞體內(nèi)代謝后，將雞宰殺取前胸肉，使用電動肉丸機制成肉糜；將肉糜放入拍擊均質(zhì)器中，以150 ~ 200次/min的頻率拍擊5 ~ 10 min，反復(fù)拍擊3次，從不同位置隨機抽取5份肉糜樣品進(jìn)行均勻性初檢，確定樣品滿足均勻條件后，將肉糜冷凍干燥，并粉碎過篩，篩孔尺寸為0.425 mm（35目）；用鋁箔袋抽真空包裝雞肉凍干粉，每袋約6 ~ 10 g，貼上編號標(biāo)簽；以12 kGy的60Co－γ－射線進(jìn)行輻照滅菌后，保存于?18 ℃冰箱中，以備均勻性和穩(wěn)定性評估。

圖1 樣品制備的流程圖Fig.1 Flow chart for sample preparation

1.4 分析方法

1.4.1 樣品前處理參考GB 29690－2013國家標(biāo)準(zhǔn)［16］檢測樣品中的尼卡巴嗪，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。該標(biāo)準(zhǔn)通過中國合格評定國家認(rèn)可委員會（CNAS）或中國計量認(rèn)證（CMA）認(rèn)可，適用的檢測范圍涵蓋各種動物源基質(zhì)，對準(zhǔn)確度、重復(fù)性、重現(xiàn)性均進(jìn)行了驗證，使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行外標(biāo)定量和內(nèi)標(biāo)定量均是目前公認(rèn)的進(jìn)行獸藥殘留檢測可靠準(zhǔn)確的定量方法，可保證結(jié)果溯源的有效性。

1.4.2液相色譜條件色譜柱：Kinetex?（3.0 mm × 50 mm，2.6 μm）；流動相：A相為水，B相為乙腈；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為2 μL；流速為0.4 mL/min。梯度洗脫條件：0 ~ 2.00 min，10% B；2.00 ~ 2.10 min，10% ~ 50% B；2.10 ~ 3.50 min，50% ~ 80% B；3.50 ~ 7.00 min，80% B；7.00 ~ 7.01 min，80% ~ 10% B；7.01 ~ 10.0 min，10% B。

1.4.3 質(zhì)譜條件多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描模式；電噴霧離子源（ESI）；負(fù)離子掃描；離子化電壓（IS）：?4 500 V；氣簾氣（CUR）壓力：241 kPa（氮氣）；離子源溫度（TEM）：500 ℃；霧化氣壓力：276 kPa；輔助加熱氣壓力：276 kPa。尼卡巴嗪與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 尼卡巴嗪與內(nèi)標(biāo)的主要質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of nicarbazin and its internal

1.5 均勻性評估

均勻性是標(biāo)準(zhǔn)樣品研制過程中必須保證的屬性，會影響最小取樣量和特性值的準(zhǔn)確性。根據(jù)GB/T 15000.3－2008標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則（3）－標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法［17］，隨機抽取15份樣品，每份樣品抽取3份子樣進(jìn)行測定，共45組數(shù)據(jù)。使用單因素方差分析法對均勻性數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，從而判斷樣品的均勻性。

1.6 穩(wěn)定性評估

穩(wěn)定性也是標(biāo)準(zhǔn)樣品研制過程中必須保證的屬性，包括短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性。短期穩(wěn)定性是評估樣品在極端運輸溫度和實驗室搬運條件下保持特性值穩(wěn)定的能力；長期穩(wěn)定性是評估標(biāo)準(zhǔn)樣品在生產(chǎn)者規(guī)定貯存條件下保持特性值穩(wěn)定的時間，是標(biāo)準(zhǔn)樣品有效期的重要依據(jù)。

1.6.1 短期穩(wěn)定性研究為評估標(biāo)準(zhǔn)樣品在極端條件下的穩(wěn)定性，取獨立包裝的雞肉粉分別置于?70、4、25、50 ℃條件下，保存14 天后開袋測定，每袋抽取3份子樣進(jìn)行測定，采用F-檢驗法對短期穩(wěn)定性測定結(jié)果進(jìn)行分析。

1.6.2 長期穩(wěn)定性研究為評估標(biāo)準(zhǔn)樣品的有效期，將樣品長期保存于?18 ℃冰箱中，分別在第0、1、2、4、6、9、12個月從冰箱中取出2袋樣品，每袋抽取3份子樣進(jìn)行測定。使用t檢驗對長期穩(wěn)定性測定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.7 定值與不確定度分析

本批標(biāo)準(zhǔn)樣品采用協(xié)同定值的方式，邀請8家在食品獸藥殘留檢測領(lǐng)域具有資質(zhì)的實驗室（分別編號01 ~ 08），通過快遞郵寄（包裝盒中帶有冰塊），每個實驗室分發(fā)3份樣品，每份樣品抽取2份子樣進(jìn)行測定?；厥战Y(jié)果后，對8家實驗室的定值結(jié)果進(jìn)行正態(tài)分布分析和離群值檢驗，依次采用夏皮洛－威爾克（Shapiro－Wilk）檢驗、柯克倫（Cochran）檢驗、格拉布斯（Grubbs）檢驗。由于采用快遞分發(fā)樣品，短期運輸所引起的不確定度已包含在各實驗室的檢測值中，不再單獨計算。故不確定度包括定值標(biāo)準(zhǔn)不確定度uchar、均勻性檢驗的不確定度ubb和長期穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)不確定度ults。

2 結(jié)果與討論

2.1 藥物代謝預(yù)實驗

按每1 kg飼料混合0.15 g尼卡巴嗪，對實驗白羽雞進(jìn)行飼料口服喂藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥3天。停藥后第1天至第10天，每日宰殺2只白羽雞取樣，測定尼卡巴嗪殘留量。圖2表明，在停止喂藥后的第4天，雞肉中尼卡巴嗪的含量趨于穩(wěn)定，并達(dá)到預(yù)期濃度水平。因此，陽性樣品的采集選擇在停藥后的第4天。

圖2 給藥后雞肉中尼卡巴嗪殘留量隨時間的變化Fig.2 Changes of nicarbazin residues in chicken meat after drug application

2.2 樣品的制備

選取體質(zhì)量約1 kg的白羽肉雞30只，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果進(jìn)行喂藥實驗，在停藥后的第4天采集陽性樣品。使用電動肉丸機與拍擊均質(zhì)器將樣品制成均勻肉糜，經(jīng)過冷凍干燥、粉碎、過篩、真空包裝，制備了355份獨立包裝的標(biāo)準(zhǔn)樣品，貼上編號標(biāo)簽。以12 kGy的60Co－γ－射線進(jìn)行輻照滅菌，輻照后樣品按GB 4789.2－2016［18］測定細(xì)菌總數(shù)，檢測值小于10 CFU/g。

2.3 樣品的測定

樣品測定前，需將雞肉凍干粉恢復(fù)肉糜狀態(tài)，通過測定冷凍干燥前后的樣品含水量，確定以3倍凍干粉質(zhì)量的水進(jìn)行復(fù)水實驗，同時考察了不同稱樣量（0.10、0.25、0.50 g）和不同復(fù)水時間（10、20、30、40 min）對檢測結(jié)果的影響。按條件共設(shè)計12組實驗，組1 ~ 4、組5 ~ 8、組9 ~ 12分別按稱樣量0.10、0.25、0.50 g在不同復(fù)水時長條件下進(jìn)行分析，每組平行測定6次，計算每組的平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。如圖3所示，組11的測定值標(biāo)準(zhǔn)偏差最小且測定值符合預(yù)期，即稱取0.5 g雞肉凍干粉樣品，加入1.5 g蒸餾水充分復(fù)水30 min，其分析結(jié)果的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性最好，故后續(xù)實驗采用該條件復(fù)水。

圖3 復(fù)水條件分析結(jié)果Fig.3 Analysis results of rehydration conditions

樣品按“1.4.1”前處理后與標(biāo)準(zhǔn)品上機檢測，得到尼卡巴嗪標(biāo)準(zhǔn)品以及雞肉凍干粉中尼卡巴嗪的選擇離子監(jiān)測色譜圖。如圖4所示，離子對的峰形良好，無雜峰干擾，且樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間一致，表明可以準(zhǔn)確測定樣品中的尼卡巴嗪。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）及樣品（B）的選擇離子監(jiān)測色譜圖Fig.4 Selected ion chromatograms of standard solution（A） and reference material（B）

2.4 均勻性檢驗結(jié)果

根據(jù)方差分析原理確定自由度（v1，v2），計算組內(nèi)的均方差和組間的均方差，按方差檢驗給定的方法計算統(tǒng)計量F，查F分布表找出臨界值F0.05（14，30），進(jìn)行比較以判斷標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性。檢驗結(jié)果如表2所示，F(xiàn)= 1.59

表2 尼卡巴嗪標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性檢驗結(jié)果（n = 3）Table 2 Homogeneity test results of nicarbazin reference material（n = 3）

2.5 穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

經(jīng)過14 天的不同溫度條件保存，樣品未出現(xiàn)脹包、微生物腐敗、樣品變質(zhì)等不正常狀態(tài)。檢測數(shù)據(jù)及分析結(jié)果如表3所示，在顯著水平α= 0.05時，F(xiàn)=3.77

表3 標(biāo)準(zhǔn)樣品的短期穩(wěn)定性結(jié)果（n = 3）Table 3 Short term stability results of reference material（n = 3）

t檢驗法是計算回歸參數(shù)b1（斜率）和b0（截距），通過誤差分析計算b1的標(biāo)準(zhǔn)偏差s（b1）。采用s（b1）和t0.95，n－2的顯著性判斷樣品的穩(wěn)定性。表4為樣品在第0、1、2、4、6、9、12個月的抽查檢測結(jié)果與數(shù)據(jù)分析，查表得自由度n－2和p= 0.95（95%置信水平）的分布t因子為2.571，由于斜率變化的絕對值|b1|

表4 標(biāo)準(zhǔn)樣品的長期穩(wěn)定性結(jié)果（n = 6）Table 4 Long term stability results of reference material（n = 6）

2.6 定值與不確定度分析

2.6.1 定值本批標(biāo)準(zhǔn)樣品邀請8家實驗室定值，參加協(xié)同定值的實驗室均通過了國家計量認(rèn)證或中國國家合格評定委員會的認(rèn)可并在有效周期內(nèi)。定值實驗室所用檢測設(shè)備、計量器具均按照相關(guān)檢定校準(zhǔn)規(guī)程由計量部門進(jìn)行檢定或校準(zhǔn)。定值結(jié)果如表5所示?；厥盏亩ㄖ到Y(jié)果通過Shapiro－Wilk檢驗計算得W= 0.927 >W0.95（48）= 0.916，檢測數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布；通過Cochran檢驗計算統(tǒng)計量C= 0.190 4

表5 協(xié)同定值結(jié)果Table 5 Cooperative setting value

2.6.2 不確定度評估①測定值標(biāo)準(zhǔn)不確定度uchar：

測定值標(biāo)準(zhǔn)不確定度包括實驗室檢測環(huán)境、儀器條件、檢測方法、檢測人員不同等產(chǎn)生的不確定度，計算公式為：

其中：s為標(biāo)準(zhǔn)偏差，p代表實驗室數(shù)，Yi為各實驗室數(shù)據(jù)的平均值，Yˉ為總平均值。

②均勻性檢驗不確定度ubb：ubb=sbb。

其中：sbb為瓶間標(biāo)準(zhǔn)偏差，為瓶間方差，為瓶內(nèi)方差，n為測量次數(shù)。

③長期穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)不確定度ults：

本批標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了為期12個月的長期穩(wěn)定性檢測（t= 12），采用直線為經(jīng)驗?zāi)Ｐ停跓o顯著降解的情況下，ults的計算公式為：ults=s（b1） ×t。

④擴(kuò)展不確定度UCRM：

將數(shù)值代入公式，本批標(biāo)準(zhǔn)樣品的不確定度結(jié)果如表6所示。在置信水平為95%（k= 2）時，擴(kuò)展不確定度為11.0，最終確定標(biāo)準(zhǔn)值為（157.7 ±11.0） μg·kg?1（k= 2）。

表6 不確定度分析結(jié)果Table 6 Analysis results of uncertainty

3 結(jié) 論

通過模擬自然藥物代謝殘留過程，得到獲取陽性雞肉樣品的最佳條件，制備了一批符合預(yù)期含量水平的雞肉中尼卡巴嗪基體標(biāo)準(zhǔn)樣品。該標(biāo)準(zhǔn)樣品在進(jìn)行雞肉中尼卡巴嗪殘留分析時，可用于校準(zhǔn)儀器、確認(rèn)和評價分析方法、考核檢測人員技術(shù)水平等，也可用于保證食品分析量值溯源的有效性，為后續(xù)開展各類獸藥殘留基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制提供了參考。