徐雨晗，包垠秋，易 陽，艾有偉，王宏勛，閔 婷*

（1 武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 武漢 430023 2 武漢輕工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 武漢 430023）

蓮藕是營養(yǎng)豐富的水生蔬菜，且具有一定藥用價(jià)值。 近些年來，鮮切蓮藕逐步走向市場，受到廣大消費(fèi)者的喜愛。有研究表明，酶促褐變是導(dǎo)致鮮切蓮藕片貨架期質(zhì)量下降的主要因素，其主要反應(yīng)是多酚向醌類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化[1]。 也有研究表明，活性氧代謝與褐變密切相關(guān)，提高鮮切蓮藕的抗氧化能力，能延緩褐變的發(fā)生[2]。 目前化學(xué)處理在鮮切蓮藕保鮮中的應(yīng)用最為廣泛，如H2S[2]、草酸[3]、ClO2[4]及表油菜素內(nèi)酯[5]處理均能有效延緩鮮切蓮藕的褐變，然而，化學(xué)試劑的安全性問題須引起足夠的重視。

乙醇處理作為一種安全無毒、 化學(xué)污染小的保鮮技術(shù)，可以調(diào)節(jié)果蔬生理代謝速度[6]，減少果蔬微生物的生長和營養(yǎng)物質(zhì)消耗，保持高質(zhì)量的果蔬品質(zhì)。 同時(shí)，乙醇處理能夠抑制果蔬的褐變，包括萵苣[7]、鮮切甘蔗[8]、鮮切山藥[9]、雙孢蘑菇[10]等。 此外，乙醇處理能夠提高果蔬的抗氧化能力，在木薯[11]、櫻桃番茄[12]、楊梅[13]、西蘭花[14]的 研究中都得到證實(shí)。目前，關(guān)于乙醇處理鮮切蓮藕的報(bào)道較少。Gao 等[15]研究表明鮮切蓮藕采用乙醇和抗壞血酸溶液單獨(dú)處理或聯(lián)合處理，能夠保持鮮切蓮藕的品質(zhì)，延緩褐變，抑制微生物生長。然而，目前缺乏乙醇處理抑制鮮切蓮藕褐變的機(jī)制研究。 本試驗(yàn)以蓮藕為材料，研究10 ℃貯藏條件下150 μL/L 乙醇熏蒸處理2 h 對鮮切蓮藕褐變的影響，并以酚類代謝和活性氧代謝為切入點(diǎn)，探討外源乙醇處理延緩鮮切蓮藕褐變的作用機(jī)理，以期為鮮切蓮藕的貨架保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試‘鄂蓮5 號(hào)’蓮藕，武漢市漢口北四季青農(nóng)貿(mào)城。

乙醇 （分析純級）、 福林酚、 無水碳酸鈉、NaH2PO4、Na2HPO4、沒食子酸、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、H2O2、PEG 6000、PVPP、95%乙 醇、NaCl、2-硫代巴比妥酸、氯化羥胺、抗壞血酸、草酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸，上海凜恩科技發(fā)展有限公司；2，6-二氯靛酚鈉鹽，源葉生物科技有限公司；Trition X-100，白鯊生物科技有限公司；苯丙氨酸解氨酶（PAL）試劑盒、過氧化氫含量測定試劑盒、過氧化氫酶（CAT）活性測定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性測定試劑盒、羥基自由基產(chǎn)生速率測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；其它所用試劑均為分析純級。

1.2 設(shè)備與儀器

JZ-300 通用色差計(jì)，深圳市金淮儀器設(shè)備有限公司；MIR-154 型低溫貯藏箱，日本三洋電機(jī)株式會(huì)社；EOS 550D 相機(jī)，佳能（中國）有限公司；塑料薄膜封口機(jī)，溫州市興業(yè)機(jī)械設(shè)備有限公司；切菜機(jī)CHD-40，濟(jì)南宏泰食品機(jī)械有限公司；XZ-10DTD 超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；V-1100D 型可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乙醇熏蒸最佳時(shí)間和濃度的篩選試驗(yàn) 將‘鄂蓮5 號(hào)’蓮藕在4 ℃的冰箱中預(yù)冷24 h，剔除有病害蟲害和機(jī)械損傷嚴(yán)重的蓮藕；選擇短、粗、大小均一，色澤一致的蓮藕作為試驗(yàn)材料。用清水洗去蓮藕表面污泥，去皮后，將其切成約4 mm 厚度的藕片。將切好的藕片置于清水中，在水中通臭氧5 min，以進(jìn)行減菌處理。 將減菌處理后的蓮藕片分成乙醇熏蒸組和對照組（CK）。 乙醇熏蒸組：將藕片從清水中撈出，甩干表面水分，平鋪在塑料貨架（370 mm×350 mm×60 mm）上，將鋪好藕片的貨架放入熏蒸裝置上層（裝置體積為56 L）。 在裝置下層放置一塊滴有一定濃度酒精的紗布，打開裝置內(nèi)的電風(fēng)扇后，在裝置表面覆上3 層保鮮膜，將蓋好蓋子的熏蒸裝置在10 ℃冰箱放置2 h。 熏蒸完成后，將鮮切蓮藕用PE 包裝袋包裝，于10℃冰箱中貯藏14 d。 對照組：熏蒸裝置中不滴入酒精，不開啟電扇，其它操作與乙醇熏蒸組相同。

在乙醇熏蒸濃度篩選預(yù)試驗(yàn)中，分別選用了100，150，200，250，300 μL/L 的乙醇熏蒸處理鮮切蓮藕片2 h，發(fā)現(xiàn)150 μL/L 的乙醇熏蒸處理，蓮藕的褐變程度最輕，L*值最高，因此150 μL/L 為最佳熏蒸濃度。在乙醇熏蒸時(shí)間篩選的預(yù)試驗(yàn)中，使150 μL/L 乙醇熏蒸處理藕片的時(shí)間分別為0.5，1，2，3，4 h，根據(jù)外觀品質(zhì)和L*值的變化，150 μL/L 乙醇熏蒸處理2 h 的鮮切蓮藕片有最佳的外觀和最高的L*值，因此選用150 μL/L 乙醇熏蒸處理鮮切蓮藕2 h 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，對照組和乙醇熏蒸處理組各項(xiàng)指標(biāo)分別在0，2，4，6，8，10，12 d 測定。

1.3.2 乙醇熏蒸處理對鮮切蓮藕褐變的影響試驗(yàn)感官品質(zhì)采用佳能EOS 550D 相機(jī)在小型攝影棚中拍攝。表面色差的變化采用JZ-300 通用色差計(jì)測量，記錄L*值，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。 褐變度測定方法參照Min 等[1]方法。 取3.0 g 蓮藕組織樣品于30 mL 蒸餾水中，在冰浴條件下勻漿，在4 ℃下以10 000 r/min 離心10 min，取上清液在25 ℃下保溫5 min，在410 nm 波長下測定吸光度，褐變度表示為OD410nm×10，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.3.3 乙醇熏蒸處理對鮮切蓮藕酚類代謝的影響試驗(yàn) 總酚含量根據(jù)Folin-Ciocalteu 方法測定[1]，結(jié)果表示為沒食子酸當(dāng)量mg/kg FW。每個(gè)樣品重復(fù)3 次。 總醌含量測定參考Yan 等[7]的方法，將5.0 g 鮮切蓮藕組織于50 mL 離心管中，加入20 mL 甲醇，以10 000 r/min 勻漿1.2 min，勻漿完畢后以10 000 r/min 在4 ℃離心10 min，取上清液在437 nm 波長處測定其吸光度，可溶性醌表示為OD437nm。 每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

使用苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine enzyme，PAL）測試盒測定鮮切蓮藕中PAL 活力。一個(gè)PAL活力單位定義為每g 組織在每mL 反應(yīng)體系中使290 nm 波長處吸光度值變化0.1 所需的酶量。 每個(gè)樣品重復(fù)3 次。使用Min 等[1]的方法測定多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）活性。 一個(gè)PPO 酶活力單位定義為每min 引起吸光度改變0.001 所需酶量。 每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.3.4 乙醇熏蒸處理對鮮切蓮藕ROS 代謝的影響試驗(yàn) 超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率使用鹽酸羥胺法[16]測定。 超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率定義為每min 每g 果蔬組織產(chǎn)生的超氧陰離子的物質(zhì)的量，表示為nmol/（min·g），每個(gè)樣品重復(fù)3 次。 羥自由基生成速率和過氧化氫含量分別使用羥基自由基測定試劑盒和過氧化氫含量測定試劑盒測定，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

分別使用總超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒和過氧化氫酶（Catalase，CAT）測定試劑盒測定鮮切蓮藕中SOD 和CAT 酶活力。 一個(gè)SOD 活力單位定義為在1 mL 反應(yīng)溶液中每g 組織的SOD 抑制率達(dá)到50%，一個(gè)CAT活力單位定義為每g 組織每s 分解1 μmol 過氧化氫。 每個(gè)樣品重復(fù)3 次。 使用Min 等[1]方法測定過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性。 一個(gè)POD 酶活力單位定義為每min 引起吸光度變化0.01 所需的酶量。 每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

抗壞血酸含量的測定采用2，6-二氯酚靛酚滴定法[16]，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-Diphenyl -2 -trinitrophenylhydrazine，DPPH） 自由基清除率的測定參考Yi 等[17]的方法，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇熏蒸處理對鮮切蓮藕褐變的影響

鮮切果蔬的褐變程度會(huì)影響消費(fèi)者的購買欲望，乙醇熏蒸處理后鮮切蓮藕的褐變程度變輕。由圖1a 可知，在貯藏處理前期，鮮切蓮藕的外表顏色為亮白色，經(jīng)過12 d 貯藏，對照組的鮮切蓮藕表面呈棕褐色，處理組的鮮切蓮藕呈淺棕色。 如圖1b～1c 所示，在貯藏過程中，鮮切蓮藕的褐變度不斷上升，L*值不斷下降，乙醇處理顯著延緩了鮮切蓮藕褐變度的上升和L*值的下降（P<0.05）。 經(jīng)過12 d 貯藏，處理組的褐變度比對照組低6%，L*值比對照組高19%。

圖1 乙醇熏蒸處理對鮮切蓮藕片褐變的影響Fig.1 Effects of ethanol vapor treatment on browning of fresh-cut lotus root slices

2.2 乙醇熏蒸處理對鮮切蓮藕酚類代謝的影響

2.2.1 對總酚和總醌含量的影響 酚類物質(zhì)向醌類物質(zhì)的轉(zhuǎn)換是果蔬酶促褐變的重要反應(yīng)，總酚含量的降低有利于延緩褐變的發(fā)生[18]。如圖2a～2b所示，鮮切蓮藕在貯藏12 d 內(nèi)，乙醇處理顯著抑制了鮮切蓮藕中總酚和總醌含量的上升 （P<0.05），貯藏至第12 天時(shí)，對照組的總酚和總醌含量分別是對照的1.24 和1.18 倍。

圖2 乙醇熏蒸處理對鮮切蓮藕片總酚和可溶性醌含量的影響Fig.2 Effects of ethanol vapor treatment on the contents of total phenol （a） and soluble quinone （b）of fresh-cut lotus root slices

2.2.2 對PAL 和PPO 活力的影響 PAL 酶是酚類物質(zhì)合成途徑——苯丙烷代謝的限速酶[7]，在有氧環(huán)境下PPO 能促進(jìn)多酚向醌的轉(zhuǎn)化。 如圖3a～3b 所示，在整個(gè)貯藏期間，乙醇熏蒸處理顯著抑制了鮮切蓮藕PAL 和PPO 活力的上升（P<0.05），第12 天時(shí)，處理組PAL 和PPO 酶活力分別比對照組低約10%和30%。

圖3 乙醇熏蒸處理對鮮切蓮藕片PAL 和PPO 活力的影響Fig.3 Effects of ethanol vapor treatment on the activities of PAL （a） and PPO （b） of fresh-cut lotus root slices

2.3 乙醇熏蒸處理對鮮切蓮藕活性氧代謝的影響

2.3.1 對ROS 生成的影響 通過呼吸作用進(jìn)入生物體內(nèi)的氧分子，接受1 個(gè)電子后變成O2-·，O2-·能衍生成H2O2、·OH 和1O2等自由基；·OH 和H2O2的積累可引發(fā)細(xì)胞質(zhì)膜上不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生活性氧自由基，對機(jī)體產(chǎn)生傷害，從而導(dǎo)致果蔬品質(zhì)下降[16]。 由圖4a 可知，貯藏期間鮮切蓮藕的O2-·生成速率先略下降，然后在第4 天上升至峰值，最后持續(xù)降低，乙醇處理顯著抑制了低溫貯藏期間鮮切蓮藕的O2-·生成速率（P<0.05）。 由圖4b～4c 可知，貯藏期間鮮切蓮藕的·OH 產(chǎn)生速率和H2O2均呈先上升后下降的趨勢，乙醇處理顯著抑制了H2O2的積累（P<0.05），同時(shí)降低了·OH 產(chǎn)生速率，然而與對照之間差異不顯著（P>0.05）。

圖4 乙醇熏蒸處理對鮮切蓮藕片ROS 積累的影響Fig.4 Effects of ethanol vapor treatment on the ROS accumulation of fresh-cut lotus root slices

2.3.2 對抗氧化酶活力的影響 SOD 能通過歧化反應(yīng)清除生物細(xì)胞中的超氧自由基（O2-·），并與CAT、POD 等酶共同抵御活性氧或其它過氧化物自由基對細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害[16]。 如圖5a 所示，在貯藏期間，處理組和對照組的SOD 活力較第0 天都有所提高，且處理組的SOD 活力高于對照組，在貯藏12 d 時(shí)，處理組的SOD 活力是對照組的1.02 倍。由圖5b 可知，在貯藏過程中，CAT 活力呈先上升后降低的趨勢，處理組的CAT 活力顯著高于對照組（P<0.05）。 如圖5c 所示，在2～8 d，處理組的POD 活力顯著高于對照組（P<0.05）。 在貯藏末期，乙醇熏蒸對POD 酶活力的提高作用消失，甚至對照組酶活力高于處理組。

圖5 乙醇熏蒸處理對鮮切蓮藕片SOD、CAT和POD 活力的影響Fig.5 Effects of ethanol vapor treatment on the activities of SOD （a），CAT （b），and POD activity （c）of fresh-cut lotus root slices

2.3.3 對非酶促抗氧化能力的影響 抗壞血酸含量和DPPH 自由基清除能力是評價(jià)果蔬貯藏品質(zhì)非酶促抗氧化能力的重要指標(biāo)[18]，由圖6a 可知，在整個(gè)貯藏過程中，鮮切蓮藕的抗壞血酸含量持續(xù)下降，乙醇熏蒸處理顯著抑制了抗壞血酸的損失（P<0.05），貯藏至12 d，CK 組的抗壞血酸含量下降約41%，乙醇熏蒸組下降約34%。 由圖6b 可知，DPPH 自由基清除率先上升后下降，貯藏期間處理組中DPPH 自由基清除率較對照組有所提高，而兩者之間差異不顯著（P>0.05）。 兩組鮮切蓮藕片的DPPH 自由基清除率均在第4 天左右出現(xiàn)峰值，在該天處理組的DPPH 自由基清除率是對照組的1.08 倍。

圖6 乙醇熏蒸處理對鮮切蓮藕片抗壞血酸含量和DPPH 自由基清除率的影響Fig.6 Effects of ethanol vapor treatment on the ascorbic acid contents and DPPH free radical scavenging capacity of fresh-cut lotus root slices

3 結(jié)論與討論

鮮切蓮藕加工過程中要經(jīng)過去皮、 切分和包裝等一系列加工程序，這些工序加快了鮮切蓮藕的褐變。本研究采用乙醇熏蒸處理鮮切蓮藕，發(fā)現(xiàn)150 μL/L 乙醇熏蒸處理能有效維持鮮切蓮藕的外觀品質(zhì)和L*值，顯著降低表面褐變程度。 在其它果蔬中也有類似的發(fā)現(xiàn)，200 μL/L 乙醇熏蒸處理鮮切山藥[9]，400 μL/L 乙醇熏蒸處理雙孢蘑菇[10]和200 mL/L 乙醇浸泡處理鮮切萵苣[7]能降低果蔬表面褐變程度，然而不同品種的果蔬乙醇處理濃度和處理方式存在差異。

大量研究證實(shí)，鮮切蓮藕褐變主要是由酶促褐變引起，酚類代謝是酶促褐變的重要途徑。 PAL酶是酚類物質(zhì)形成的關(guān)鍵酶，乙醇熏蒸處理顯著抑制了鮮切蓮藕PAL 酶活力。 PAL 酶活力的降低有助于延緩褐變[19]，Yan 等[7]在鮮切生菜的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)，且該研究認(rèn)為乙醇處理對PAL 酶活力的抑制作用與PAL 相關(guān)酶基因的表達(dá)下調(diào)相關(guān)。 與PAL 酶活力降低相對應(yīng)，乙醇熏蒸處理后鮮切蓮藕中總酚含量顯著降低，與前人在鮮切萵苣[7]和雙孢蘑菇[20]中的報(bào)道結(jié)果一致。 PPO 能夠催化酚類物氧化形成醌類物質(zhì)，乙醇處理顯著降低了鮮切蓮藕中的PPO 活力。彭益強(qiáng)等[21]提出，乙醇分子中羥基和鄰苯二酚等酚類化合物化學(xué)性質(zhì)較為相似，其可通過與PPO 的底物競爭酶活性中心基團(tuán)的方式抑制PPO 酶活力。 鮮切蓮藕貯藏過程中，醌類物質(zhì)的大量積累導(dǎo)致黑色素的形成，乙醇熏蒸能夠抑制醌類物質(zhì)的積累，從而減輕褐變。這不僅與外觀上深褐色變淺相對應(yīng)，還與總酚含量降低和PAL 和PPO 酶活力的降低相對應(yīng)。 因此，乙醇處理能夠通過抑制鮮切蓮藕在貯藏過程中的酚類代謝，從而減輕褐變。

ROS 有多種形式，超氧陰離子自由基（O2-·）、羥基自由基（·OH）和過氧化氫（H2O2）等均為常見的ROS[22]。 本研究中，乙醇處理能夠減少細(xì)胞內(nèi)H2O2含量的積累，降低O2-·產(chǎn)生速率及·OH 生成能力，通過降低活性氧代謝產(chǎn)物的生成速率，減輕活性氧對細(xì)胞造成的傷害。 Liu 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，乙醇處理可有效降低木薯的H2O2含量及O2-·生成速率，與本研究結(jié)果一致?？寡趸冈诤肿円种浦衅鹬P(guān)鍵作用，SOD、CAT 和POD 等作為酶促防御系統(tǒng)中主要的代謝酶，能清除自由基，減輕膜的過氧化，維持膜的穩(wěn)定性[23]。 在本研究中，乙醇熏蒸處理后的鮮切蓮藕片中有SOD、CAT 和POD 同步激活的現(xiàn)象，這與乙醇處理后鮮切蓮藕具有更好的外觀相一致。這些結(jié)果表明，乙醇誘導(dǎo)的抗氧化酶活力提升可能是蓮藕片褐變抑制的關(guān)鍵條件。在乙醇熏蒸處理鮮切西蘭花[24]和鮮切草莓[25]中也發(fā)現(xiàn)了乙醇處理對植物酶促抗氧化系統(tǒng)的促進(jìn)作用。 Han 等[24]研究發(fā)現(xiàn)乙醇熏蒸能提高鮮切西藍(lán)花的SOD、CAT 和POD 酶活力以延緩其衰老，Li 等[25]的研究表明乙醇熏蒸通過上調(diào)抗氧化酶基因來誘導(dǎo)酶活力的提升。此外，乙醇熏蒸也能提高鮮切蓮藕的非酶促抗氧化能力，主要體現(xiàn)在顯著抑制抗壞血酸含量的損失和顯著提升DPPH 自由基清除能力兩個(gè)方面，與前人在櫻桃番茄[12]、楊梅[13]和西蘭花[14]中獲得的結(jié)果相似。

綜上所述，150 μL/L 乙醇熏蒸處理鮮切蓮藕2 h 能有效延緩貯藏期間鮮切蓮藕褐變的發(fā)生，其不僅能夠維持鮮切蓮藕的感官品質(zhì)，還能顯著延緩鮮切蓮藕的褐變度的上升和L*值的下降。 進(jìn)一步研究表明，乙醇熏蒸處理抑制了鮮切蓮藕的酚類代謝，表現(xiàn)為顯著降低總酚和可溶性醌含量，顯著抑制PAL 和PPO 酶活力。 同時(shí)，乙醇熏蒸處理提高了鮮切蓮藕的抗氧化水平，其不僅顯著降低了O2-·生成速率和H2O2含量，還能顯著提高CAT、POD 活力和抗壞血酸含量。 此外，乙醇處理對抑制·OH 的生成速率，提高SOD 活力和DPPH自由基清除率有一定積極作用，然而與對照之間差異不顯著。以上結(jié)果表明，乙醇熏蒸處理能夠通過抑制鮮切蓮藕的酚類代謝，提高抗氧化水平，有效減輕鮮切蓮藕褐變。