謝 潔，馬小媛*，王周平

（1 江南大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室 江蘇無錫 214122 2 江南大學食品學院 江蘇無錫 214122）

敵百蟲（TCF）是一種常見的有機磷農(nóng)藥，常用于水稻、馬鈴薯、玉米、小麥等農(nóng)作物，起到殺蟲、殺菌、除草等作用。然而，農(nóng)藥的實際利用率約為15%，大部分農(nóng)藥會殘留在環(huán)境中，對土壤、海洋、大氣和作物造成污染，最終影響人類健康[1-3]。目前對有機磷農(nóng)藥的檢測多采用色譜檢測法[4-6]以及基于生物學的檢測技術(shù)，包括酶抑制法[7]、免疫分析法[8]、傳感器法[9]等，它們的檢測結(jié)果準確，然而，通常成本較高，操作過程較為復(fù)雜，不適合現(xiàn)場快速檢測。

表面增強拉曼光譜（SERS）是一種利用粗糙的金屬表面對待測分子的拉曼信號進行增強的光散射現(xiàn)象。近年來，隨著各種納米制造技術(shù)日益成熟，以及SERS 技術(shù)獨特的指紋識別特性和高靈敏性，使其在化學分析、生物醫(yī)學、材料科學等領(lǐng)域得到迅速發(fā)展[10-12]。 制備高質(zhì)量的基底是SERS技術(shù)應(yīng)用于各個領(lǐng)域的重要前提，常見的基底有金屬溶膠和固態(tài)基底兩大類。 剛性固態(tài)基底不易彎曲，且容易斷裂，當目標分子在不規(guī)則樣品表面時，不能與樣品完全接觸，使得它們難以有效地收集目標分子。為克服這些缺點，柔性固態(tài)襯底成為新興的研究對象。

膠帶在日常生活中很常見，用途廣泛，在科學研究領(lǐng)域也有巨大的應(yīng)用潛力。 本文設(shè)計了一種膠帶襯底與金納米片（AuNTs）結(jié)合的柔性SERS基底，膠帶不僅具有彎曲易貼合的特點，同時其黏性可使其作為目標分析物的提取工具，在現(xiàn)場檢測時對實際樣品表面的農(nóng)藥進行提取，實現(xiàn)快速檢測，而AuNTs 具有的銳利尖端，能夠產(chǎn)生更強的拉曼增強信號。 AuNTs/膠帶SERS 基底可以在沒有任何有機溶液的情況下實現(xiàn)完整的提取和檢測步驟，可用于食品安全中實際樣品分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯金酸（HAuCl4·3H2O）、 抗壞血酸（Ascorbic acid，AA）、碘化鉀（KI）、氫氧化鈉（NaOH），中國國藥集團化學試劑公司（上海）；尼羅蘭A（Nile Blue A，NBA）、敵百蟲（Trichlorfon，TCF），阿拉丁化學試劑有限公司（中國）；十六烷基三甲基氯化銨（Hexadecyl trimethyl ammonium chloride，CTAC），Sigma-Aldrich 公司（美國）；單面膠帶（得力品牌），當?shù)爻?；超純水?8.2 mΩ）由美國Millipore 凈水系統(tǒng)（Direct-Q3）制備生成。

1.2 儀器與設(shè)備

JEM-2100（200 kV）透射電子顯微鏡，日本電子公司（JEOL Ltd，日本）；UV-1800 紫外-可見光（UV-vis）分光光度計，日本島津公司；SU8100 冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本株式會社日立高新技術(shù)；LabRAM HR 800 共聚焦顯微拉曼光譜儀，法國HORIBA 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 AuNTs 的合成 根據(jù)Chen 等[13]的方法制備AuNTs，先在單口圓底燒瓶中加入8 mL 超純水和1.6 mL 0.1 mol/L CTAC，隨后依次加入75 μL 10 mmol/L KI，80 μL 25.4 mmol/L HAuCl4和20.3 μL 0.1 mol/L NaOH，溶液變成淺黃色。再加入80 μL 0.064 mol/L AA 溶液，溶液變成無色后，快速注入10 μL 0.1 mol/L NaOH，攪拌，溶液由無色變成紅色，紫色，藍色。 10 min 內(nèi)完成生長過程。

1.3.2 AuNTs 滴加濃度的優(yōu)化 將合成的AuNTs溶液在8 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心10 min，去除上清，重懸。滴加3 μL 濃度為10-5mol/L 的NBA 于透明膠帶黏性面上，室溫干燥后滴加3 μL 不同濃縮倍數(shù)（2，4，6，8，10 倍）的AuNTs 溶液，室溫干燥，將膠帶黏性面朝下與包裹錫紙的載玻片貼合，并進行拉曼測試。

共聚焦顯微拉曼光譜儀的參數(shù)設(shè)置如下：激發(fā)波長785 nm，掃描范圍200～2 000 cm-1，物鏡放大倍數(shù)50×，掃描時間5 s，循環(huán)次數(shù)3 次，每個樣品上隨機選取10 個測試點。 通過重復(fù)試驗3 次，獲取平均SERS 光譜。

1.3.3 AuNTs/膠帶SERS 基底的重現(xiàn)性和靈敏性表征 AuNTs/膠帶SERS 基底重現(xiàn)性評估： 將3 μL 濃度為10-5mol/L 的NBA 溶液滴到膠帶的黏性面上，室溫干燥，再滴加3 μL 濃度優(yōu)化后的AuNTs 溶液，干燥后，將膠帶黏性面朝下粘貼在包裹錫紙的載玻片上，隨機選取10 個點，進行拉曼測試。 重復(fù)3 次。

AuNTs/膠帶SERS 基底靈敏性評估： 將3 μL不同濃度（2×10-7，4×10-7，6×10-7，8×10-7，1×10-6，2×10-6，4×10-6，6×10-6，8×10-6，1×10-5mol/L） 的NBA溶液滴到膠帶黏性面上，室溫干燥，在斑點上滴加3 μL 濃度優(yōu)化后的AuNTs 溶液，干燥后，將膠帶黏性面朝下粘貼在包裹錫紙的載玻片上，進行拉曼測試。 重復(fù)3 次。

拉曼參數(shù)設(shè)定與1.3.2 節(jié)的方法相同。

1.3.4 對TCF 標準溶液的SERS 檢測 將10 μL不同 質(zhì)量 濃度（1，2，4，6，8，10，50，100，250，500，750 μg/mL） 的TCF 標準溶液滴到膠帶黏性面上，干燥后，在斑點上滴加10 μL 質(zhì)量濃度優(yōu)化后的AuNTs 溶液，干燥后，將膠帶黏性面朝下粘貼在包裹錫紙的載玻片上，進行拉曼測試。 不滴加TCF的基底為空白樣品。

共聚焦顯微拉曼光譜儀的參數(shù)設(shè)置如下：激發(fā)波長785 nm，掃描范圍300～1 600 cm-1，物鏡放大倍數(shù)50×，掃描時間20 s，循環(huán)次數(shù)1 次，每個樣品上隨機選取10 個測試點。 通過重復(fù)試驗3 次，獲取平均SERS 光譜。

1.3.5 蘋果樣品表面TCF 的提取和檢測 將蘋果清洗干凈后削皮，把蘋果皮切成1×1 cm2的正方形，滴加10 μL 不同質(zhì)量濃度（1，2，4，6，8，10，50，100，250，500，750 μg/mL） 的TCF 溶液到果皮表面，干燥后，將膠帶粘貼到果皮上，按壓15 s 后輕輕剝離，在斑點上滴加10 μL 質(zhì)量濃度優(yōu)化后的AuNTs 溶液，干燥后，將膠帶黏性面朝下粘貼在包裹錫紙的載玻片上，進行拉曼測試。 與TCF直接滴到膠帶黏性面上得到的拉曼強度進行比較，計算膠帶在水果表面對農(nóng)殘的提取效率。

拉曼參數(shù)設(shè)定與1.3.4 節(jié)相同。通過重復(fù)試驗3 次，獲取平均SERS 光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗原理

圖1 是使用AuNTs/膠帶SERS 基底檢測實際樣品表面農(nóng)殘的流程示意圖。先通過粘貼的方式，用透明膠帶黏性面收集蘋果表面的目標分析物后，再滴加AuNTs 到膠帶上用于增強拉曼信號，然后將膠帶黏性面朝下固定在包裹錫紙的玻璃片上，拉曼激光照射，收集拉曼信號對其進行分析，實現(xiàn)對農(nóng)殘的定量檢測。

圖1 AuNTs/膠帶SERS 基底檢測TCF 的示意圖Fig.1 Schematic illustration of AuNTs/tape substrates for detecting TCF

2.2 AuNTs 的表征及滴加到膠帶基底上的濃度優(yōu)化

圖2 為AuNTs 的紫外-可見光譜圖和TEM圖，從圖2a 中可以看到，AuNTs 在641 nm 左右波長處有一個特征峰。 圖2b 顯示AuNTs 呈大小均勻的三角形片狀，尺寸約為60 nm 左右，形貌規(guī)則，分散性良好。

圖2 AuNTs 的紫外-可見光譜圖（a）和透射電鏡圖（b）Fig.2 The UV-vis spectrum （a） and the TEM image （b） of AuNTs

在膠帶黏性面上先滴加10-5mol/L 的NBA 溶液，室溫干燥后，再滴加不同濃縮倍數(shù)的AuNTs，將膠帶黏性面粘貼在包裹錫紙的載玻片上，拉曼激光從膠帶非黏性面進入，到達金屬納米結(jié)構(gòu)。這種激光從膠帶非黏性面進入的測試方法不會對基底上的金屬溶膠和目標分析物造成破壞，而且入射和散射光很容易透過膠帶且不會消散，保證了基底的高靈敏度[14-15]。 圖3a 是NBA 在不同濃縮倍數(shù)的AuNTs 下的SERS 光譜圖，可以看到NBA 在600 cm-1處有一個明顯的特征峰，這是由NBA 中帶正電的氮原子產(chǎn)生的[16]。以AuNTs 的濃度（即濃縮倍數(shù)）作為橫坐標，NBA 在600 cm-1處的峰強度為縱坐標，作折線圖，得到圖3b，隨著AuNTs 濃度的增大，NBA 在600 cm-1處的峰強度先持續(xù)增強，當濃縮倍數(shù)達到8 倍后開始保持不變。 這是由于隨著納米顆粒數(shù)量逐漸增加，顆粒之間間距減小，“熱點”數(shù)量逐漸增加，拉曼信號增強，然而當納米顆粒數(shù)量達到一定量時，“熱點”數(shù)量達到飽和，拉曼信號便不會再增加，因此使用AuNTs 濃縮8 倍時的濃度作為最佳濃度進行后續(xù)試驗。

圖3 膠帶基底上不同濃度的AuNTs 對NBA 增強的SERS 圖譜（a）； NBA 在600 cm-1 處峰強度隨AuNTs濃度的變化（b）；空白膠帶的SEM 電鏡圖（c）；滴加了AuNTs 的膠帶的SEM 電鏡圖（d）Fig.3 SERS spectra of NBA with different concentration of AuNTs （a）； the relationship between the SERS intensity at 600 cm-1 of NBA and concentration of AuNTs （b）； SEM image of blank tape （c）； SEM image of tape with AuNTs （d）

膠帶黏性面的主要化學組成是丙烯酸酯粘合劑，當AuNTs 溶液滴加到黏性面時，由于水的存在，丙烯酸酯粘合劑變得可溶脹，水分蒸發(fā)后導(dǎo)致丙烯酸酯粘合劑消溶脹。 這種溶脹和消溶脹作用使得納米材料半嵌入聚集在膠帶上[17]，通過圖3c和圖3d 可以看到，空白膠帶表面光滑平整，而滴加了AuNTs 后的膠帶表面形成了粗糙的“丘陵地形”結(jié)構(gòu)，表明AuNTs 已經(jīng)嵌入到膠帶黏性層中，這一性質(zhì)使得納米材料在檢測過程中不會發(fā)生損失，并且目標分析物在被膠帶粘貼提取之后，能與納米材料直接接觸，使得SERS 信號增強。

2.3 AuNTs/膠帶SERS 基底的性能研究

重現(xiàn)性、 穩(wěn)定性和靈敏性是考察SERS 基底活性的基本指標，由于AuNTs/膠帶SERS 基底應(yīng)用于實際檢測時，是用膠帶現(xiàn)場采樣后立即進行拉曼測試，故而不考察基底的儲存穩(wěn)定性。

為了評價AuNTs/膠帶SERS 基底的重現(xiàn)性，制備了3 條不同的膠帶基底，并在每條膠帶基底上隨機選取10 個點，共30 個點進行拉曼測試，如圖4a 所示，30 個來自不同膠帶基底上NBA 的光譜圖特征峰一致，隨后對NBA 在600 cm-1處的特征峰強度進行定量統(tǒng)計，得到圖4b，RSD 值為9.39%，表面膠帶基底的拉曼增強信號具有良好的重現(xiàn)性。

圖4 3 條不同批次AuNTs/膠帶基底上任意30 個點NBA 的SERS 圖譜（a）及其在600 cm-1 處強度的分布圖（b）Fig.4 SERS spectra of NBA acquired from 30 sites of three batches of AuNTs/tape substrates （a）and the corresponding intensity distribution at 600 cm-1 of NBA （b）

為了評價AuNTs/膠帶SERS 基底的靈敏性，將不同濃度的NBA 溶液直接滴在膠帶上進行拉曼測試。 圖5a 為濃度在2×10-7～1×10-5mol/L 范圍內(nèi)的NBA 的拉曼光譜圖，隨著NBA 濃度升高，它在600 cm-1處的特征峰強度也隨之增強，當NBA濃度低至2×10-7mol/L 時，仍可以觀察到明顯的特征峰。 以NBA 濃度為橫坐標，NBA 在600 cm-1處的特征峰強度為縱坐標進行擬合，在整個濃度范圍內(nèi)呈吸附-飽和的非線性關(guān)系（圖5b），當NBA濃度在2×10-7～1×10-6mol/L 范圍內(nèi)，NBA 在600 cm-1處的特征峰強度與濃度呈線性關(guān)系（圖5c），標準曲線方程是：y=2.673×1010x-4772.665，R2=0.9824。 結(jié)果表明AuNTs/膠帶SERS 基底具有較好的靈敏性。

圖5 AuNTs/膠帶基底上不同濃度NBA 的SERS 光譜圖（a）； NBA 濃度與其在600 cm-1 處SERS 強度的關(guān)系（b）；NBA 在低濃度時與其在600 cm-1 處SERS 強度之間的線性關(guān)系（c）Fig.5 SERS spectra of NBA with different concentrations on AuNTs/tape substrates （a）； relationship between concentration and SERS intensity at 600 cm-1 of NBA （b）； linear relationship between low concentration and SERS intensity at 600 cm-1 of NBA （c）

2.4 AuNTs/膠帶基底對TCF 的SERS 檢測

將AuNTs/膠帶SERS 基底用于實際農(nóng)藥TCF的檢測，相較于信標分子NBA，共聚焦拉曼光譜儀對TCF 的積分時間增加到了20 s，目的是增強TCF 的信號強度。 用膠帶黏性面覆蓋滴有農(nóng)殘的實際樣品表面，在一定壓力下按壓15 s，揭起后在農(nóng)殘斑點上滴加AuNTs，隨后將膠帶基底黏性面與包裹錫紙的載玻片貼合，拉曼激光從膠帶非黏性面進入。

膠帶的柔軟性在SERS 檢測中具有極大的應(yīng)用優(yōu)勢，它可以作為采樣工具用于提取樣品表面的待測物質(zhì)，省去了一系列復(fù)雜的樣品前處理過程，因此膠帶的提取效率至關(guān)重要。 將TCF 滴涂在蘋果表面再用膠帶粘貼后測得的拉曼信號（757 cm-1） 與TCF 直接滴涂在膠帶上測得的拉曼信號（757 cm-1）進行比較，統(tǒng)計膠帶對實際樣品表面不同質(zhì)量濃度TCF 的提取效率，得到表1，平均提取效率為50.9%，與之前報道過的膠帶在果皮表面的提取率相似[18]。

表1 膠帶在實際樣品（蘋果）表面的提取效率Table 1 Extraction efficiency of tape on actual sample （apple）

圖6a 是TCF 直接滴在膠帶上的光譜圖，圖6d 是TCF 滴在蘋果皮表面上用膠帶粘貼提取后進行測試的拉曼光譜圖，可以看到TCF 在434，757，1 262，1 443 cm-1處均有明顯的特征峰，434 cm-1對應(yīng)C-Cl 的拉伸模式和P=O-C 的彎曲模式，757 cm-1對應(yīng)C-Cl 的拉伸模式和C-C-P 的彎曲模式，1 262 cm-1對應(yīng)CH 和OH 的彎曲模式，1 443 cm-1對應(yīng)CH3的彎曲模式[19-20]。 以TCF 質(zhì)量濃度（1～750 μg/mL）為橫坐標，TCF 在757 cm-1處的特征峰強度為縱坐標，分別對兩種情況進行擬合，進行定量分析，結(jié)果如圖6b，6c，6e，6f 所示，在低質(zhì)量濃度（1～10 μg/mL）范圍內(nèi)，TCF 在757 cm-1處的特征峰強度與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系（圖6c），直接滴到膠帶上的標準曲線方程為：y=226.370x+193.861，R2=0.9960。

圖6 TCF 直接滴在膠帶上時SERS 光譜圖（a）；TCF 質(zhì)量濃度與其在757 cm-1 處峰強度之間的關(guān)系（b）；低質(zhì)量濃度（1～10 μg/mL）時與其在757 cm-1 處峰強度的線性關(guān)系（c）；用膠帶從樣品表面進行粘貼提取時SERS 光譜圖（d）；TCF 質(zhì)量濃度與其在757 cm-1 處峰強度之間的關(guān)系（e）；低質(zhì)量濃度（1～10 μg/mL）時與其在757 cm-1 處峰強度的線性關(guān)系（f）Fig.6 SERS spectra （a）； relationship between concentration and SERS intensity at 757 cm-1 （b）； linear relationship between low mass concentration （1～10 μg/mL） and SERS intensity at 757 cm-1 of TCF with dropping directly on the tape（c）； SERS spectra （d）； relationship between mass concentration and SERS intensity at 757 cm-1（e）； linear relationship between low mass concentration （1～10μg/mL） and SERS intensity at 757 cm-1 of TCF after extracting from actual sample （f）

根據(jù)公式計算LOD 為0.781 μg/mL （假設(shè)一個蘋果的體積大約是200 g，面積為180 cm2，根據(jù)滴加到膠帶上TCF 的體積10 μL 和形成圓形斑點的直徑5 mm，換算成國標單位即為0.0358 mg/kg），這一值低于食品安全國家標準中對水果中TCF 最大殘留限量的規(guī)定 （0.2 mg/kg，GB 2763-2016），并與已報道的方法相比較[21-26]（表2），該方法有較好的檢測性能，并能夠?qū)崿F(xiàn)快速定量檢測。用膠帶粘貼后的標準曲線方程為（圖6f）：y=115.273x+88.654，R2=0.9940。以上結(jié)果表明，該AuNTs/膠帶SERS 基底可以作為一種原位取樣和快速檢測的材料，在農(nóng)殘現(xiàn)場檢測中具有很大的應(yīng)用潛力。

表2 不同方法檢測TCF 的匯總Table 2 Summary of different methods for detecting TCF

3 結(jié)論

本研究使用膠帶作為襯底，通過將AuNTs 滴加到膠帶上來制備一種柔性AuNTs/膠帶SERS 基底，由于膠帶具有黏性，它不僅可以作為基底的襯底，還可以作為有效提取目標分析物的工具。 以NBA 作為拉曼信號分子對AuNTs/膠帶SERS 基底的重現(xiàn)性和靈敏性進行表征，對NBA 的檢測濃度低至2×10-7mol/L。 使用AuNTs/膠帶SERS 基底對TCF 標準溶液進行測試，在1～10 μg/mL 范圍內(nèi)，TCF 質(zhì)量濃度與其特征峰強度呈線性關(guān)系，LOD 可達0.781 μg/mL。使用該基底對實際樣品表面TCF 進行提取測定，提取效率為50.9%。整個分析過程簡單、 無損，樣品易于制備并且響應(yīng)速度快。