楊秋萍 李思濤 郝虎, 古霞 石聰聰 肖昕, 蔡堯

（1.中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院兒科，廣東廣州 510655；2.中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院小兒遺傳代謝病實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510655）

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜?。╮etinopathy of prematurity，ROP）是發(fā)生于早產(chǎn)及低出生體重兒的視網(wǎng)膜血管增生性疾病，是嬰幼兒最常見(jiàn)的致盲和致低視力眼?。?］。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展和早產(chǎn)兒救治水平的提高，早產(chǎn)兒、低出生體重兒的存活率不斷提升，ROP發(fā)病率也逐年上升。目前我國(guó)主要采用眼底數(shù)碼相機(jī)或者間接眼底鏡和透鏡結(jié)合的方式進(jìn)行ROP篩查，為了早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)治療，降低ROP導(dǎo)致的視力障礙等相關(guān)后遺癥，早期預(yù)測(cè)和診斷尤其重要。代謝組學(xué)是對(duì)生物體代謝組分的定性和定量分析，直觀呈現(xiàn)生物體的代謝譜，靈敏地反映生物體在疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的代謝產(chǎn)物變化［2］。Nivison-Smith等［3］發(fā)現(xiàn)氨基酸代謝與視網(wǎng)膜發(fā)育、視網(wǎng)膜疾病（尤其是發(fā)育過(guò)程中發(fā)生的）密切相關(guān)。氨基酸代謝影響了視網(wǎng)膜血管發(fā)育和張力、氧化還原反應(yīng)狀態(tài)、免疫及炎癥等功能［4］。代謝組學(xué)用于識(shí)別與疾病相關(guān)的代謝物質(zhì)變化，代謝干預(yù)有利于疾病的預(yù)防，提供尋找新治療靶點(diǎn)的機(jī)會(huì)。目前ROP患兒與代謝相關(guān)的研究有限，ROP疾病中受影響的代謝物或途徑尚不明確。本研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)與代謝組學(xué)分析方法對(duì)ROP患兒和非ROP患兒血代謝產(chǎn)物進(jìn)行回顧性分析，旨在探究ROP患兒特異性代謝標(biāo)志物，為ROP的早期識(shí)別與診斷、治療提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性選取2013年1月—2016年12月中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院住院的早產(chǎn)兒作為研究對(duì)象，記錄其出生時(shí)胎齡、體重、身長(zhǎng)、呼吸支持方式、吸氧時(shí)間、是否患新生兒呼吸窘迫綜合征（neonatal respiratory distress syndrome，NRDS） 等指標(biāo)情況。所有早產(chǎn)兒腸內(nèi)及腸外營(yíng)養(yǎng)均參考《中國(guó)新生兒營(yíng)養(yǎng)支持臨床應(yīng)用指南》［5］。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）早產(chǎn)兒，胎齡27~34周，適于胎齡兒，病程中診斷ROP的患兒為ROP組，未診斷ROP患兒為非ROP組；（2）早產(chǎn)兒母親無(wú)高血壓、糖尿病、腎臟疾病等慢性疾病，無(wú)妊娠合并癥，無(wú)吸煙、酗酒、吸毒或藥物濫用史。排除標(biāo)準(zhǔn)：患兒有顱內(nèi)出血、缺血缺氧性腦病、新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎、先天性發(fā)育畸形、染色體異常、遺傳代謝性疾病等嚴(yán)重疾病或者死亡。

1.2 ROP診斷標(biāo)準(zhǔn)

運(yùn)用間接眼底鏡和屈光度為25 D或28 D的透光鏡進(jìn)行視網(wǎng)膜檢查，觀察到視網(wǎng)膜血管分界處增生性病變、血管走行異常及不同程度的牽拉性視網(wǎng)膜脫離，則診斷ROP［6］。本研究獲得中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：2018ZSLYEC-114），研究對(duì)象監(jiān)護(hù)人均知情同意。

1.3 標(biāo)本采集

新生兒出生24 h內(nèi)，留取足跟血3滴，浸透于專用濾紙片上，每個(gè)血滴>0.8 cm，于室溫自然干燥后1周內(nèi)在我院遺傳代謝病實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行血代謝物檢測(cè)。

1.4 儀器和試劑

高效液相儀（日本島津公司）、串聯(lián)質(zhì)譜儀（API 3200 QTRAP，美國(guó)生物應(yīng)用系統(tǒng)公司）、96微孔板氮吹儀（北京眾益中和生物技術(shù)有限公司）、96孔板離心機(jī)（上海白洋）、臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Hittech公司）。新生兒血片采集卡（美國(guó)Whatman903號(hào)濾紙）、96孔過(guò)濾板（0.45 μm，美國(guó)Millipore公司），96孔聚丙烯微孔板（美國(guó)Fisher公司）、?；鈮A同位素內(nèi)標(biāo)（美國(guó)Cambridge Isotope Labs公司）、甲醇及乙腈（美國(guó)Sigma公司）。

1.5 樣本處理及檢測(cè)

用打孔器截取直徑5 mm血片，置于96孔微量過(guò)濾板中，每孔加入100 μL同位素內(nèi)標(biāo)使用液（甲醇稀釋內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液至100倍），室溫放置20 min，3 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移至96孔聚丙烯微孔板中，50℃吹干后加入60 μL鹽酸正丁醇（3 mol/L），聚四氟乙烯膜覆蓋，置于65℃恒溫箱15 min，然后50℃吹干，加入80%乙腈100 μL溶解，鋁模覆蓋，上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果運(yùn)用軟件Chemo View 1.2計(jì)算出所測(cè)樣品中代謝產(chǎn)物濃度值。

1.6 數(shù)據(jù)采集與分析

通過(guò)電化學(xué)原理將被檢測(cè)物質(zhì)分子電離成不同質(zhì)荷比（m/z）的帶電粒子，并根據(jù)m/z大小生成分離排列的圖譜對(duì)離子峰的強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，采用定量分析軟件自動(dòng)計(jì)算出所測(cè)樣本氨基酸代謝產(chǎn)物濃度值，利用SIMCA-P 13.0數(shù)據(jù)處理軟件，采用正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA） 對(duì)患兒血代謝物質(zhì)進(jìn)行分析，尋找差異代謝物。評(píng)價(jià)OPLS-DA模型匹配度的3個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)：R2X表示X矩陣解釋率；R2Y表示Y矩陣解釋率；R2X與R2Y反映了模型穩(wěn)定性；Q2表示模型預(yù)測(cè)性；R2X、R2Y、Q2三者均大于0.5表示模型匹配良好。根據(jù)OPLS-DA模型輸出聚類圖和變量得分圖（Score Plot，S-Plot），聚類圖中2組物質(zhì)分布在左右2個(gè)區(qū)域提示2組代謝物存在顯著差異；S-Plot圖中越偏向兩極的物質(zhì)具有越大的協(xié)方差和相關(guān)性，以此篩選差異代謝物，隨后進(jìn)行權(quán)重分析：根據(jù)變量差異貢獻(xiàn)（variable importance in projection，VIP）比較，篩選出VIP>1的血差異代謝物。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料用（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）M（P25，P75）描述，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采以例數(shù)和百分率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用Medcalc軟件進(jìn)行受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析，計(jì)算ROC曲線下方部分的面積（area under the curve， AUC）、 靈 敏 度 （sensitivity）、 特 異 度（specificity），評(píng)價(jià)差異代謝物對(duì)ROP的診斷預(yù)測(cè)效果，并尋找最佳的指標(biāo)診斷的截?cái)嘀怠?/p>

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒基本情況

ROP組和非ROP組各21例，臨床資料見(jiàn)表1。兩組出生胎齡、體重、出生身長(zhǎng)、吸氧時(shí)長(zhǎng)、NRDS比例的比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 ROP組與非ROP組臨床資料比較

2.2 血代謝譜模式識(shí)別分析

利用OPLS-DA模型對(duì)ROP組和非ROP組患兒血代謝譜進(jìn)行分析。ROP組和非ROP組患兒的OPLSDA模型聚類圖見(jiàn)圖1。該模型參數(shù)：R2Xcum=0.686，R2Ycum=0.907，Q2=0.522，均>0.5，表明該模型解釋能力較好，穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)性較高。ROP組和非ROP組的血代謝物質(zhì)分布在左右兩個(gè)區(qū)域，提示兩組之間血代謝產(chǎn)物存在顯著差異。

圖1 ROP患兒和非ROP患兒血代謝物的OPLS-DA聚類圖 橫坐標(biāo)t［1］表示預(yù)測(cè)組分，呈現(xiàn)組間差異；縱坐標(biāo)to［1］表示正交組分，呈現(xiàn)組內(nèi)離散程度；圓點(diǎn)旁邊數(shù)字表示樣本編號(hào)，綠色圓點(diǎn)1~21為ROP組，藍(lán)色圓點(diǎn)22~42為非ROP組。

2.3 血代謝物差異物質(zhì)篩選

根據(jù)血代謝物數(shù)據(jù)輸出S-Plot圖，圖中偏向兩極的為兩組差異較大的物質(zhì)，即最有可能為生物標(biāo)志物。位于S-Plot圖兩極的共有8個(gè)物質(zhì)（圖2紅色標(biāo)記），初步篩選差異較大的代謝物有：谷氨酸、鳥(niǎo)氨酸、甘氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、纈氨酸及精氨酸（圖2）。

2.4 血代謝物權(quán)重分析

使用OPLS-DA模型分析變量重要性得分評(píng)價(jià)變量貢獻(xiàn)，VIP值越大，代表該物質(zhì)對(duì)于區(qū)分兩組所具有的貢獻(xiàn)越大。因此篩選出VIP>1的血代謝產(chǎn)物，選擇排名前10的物質(zhì)：谷氨酸、鳥(niǎo)氨酸、甘氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、色氨酸、精氨酸、賴氨酸（表2）。

表2 ROP組和非ROP組患兒血代謝物中VIP>1的代謝物

2.5 重要血代謝物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

針對(duì)血代謝物權(quán)重分析VIP值排名前10的代謝物進(jìn)行t檢驗(yàn)或者秩和檢驗(yàn)分析：符合正態(tài)分布的谷氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸及精氨酸采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析；不符合正態(tài)分布的鳥(niǎo)氨酸、甘氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、賴氨酸，采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)分析顯示，ROP組谷氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、鳥(niǎo)氨酸、甘氨酸水平均高于非ROP組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表3。

表3 ROP組和非ROP組患兒血代謝物水平比較 （μmol/L）

2.6 ROC曲線分析預(yù)測(cè)ROP中潛在的生物標(biāo)志物

針對(duì)t檢驗(yàn)及秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析有差異的谷氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、鳥(niǎo)氨酸、甘氨酸5個(gè)氨基酸進(jìn)行ROC曲線分析，尋找潛在的代謝生物標(biāo)志物。通過(guò)比較AUC值、靈敏度、特異度，選出診斷價(jià)值較高的生物標(biāo)志物，并計(jì)算出診斷的截?cái)嘀?。AUC值越高，曲線越接近左上角（靈敏度及特異度越大），預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率越高。分析結(jié)果如表4、圖3所示，可見(jiàn)5種氨基酸都有較高的預(yù)測(cè)診斷價(jià)值，其中谷氨酸和鳥(niǎo)氨酸AUC值、靈敏度和特異度均較高，可見(jiàn)它們?cè)谧R(shí)別ROP方面是所有代謝物中最好的，其參考截?cái)嘀捣謩e為223.92 μmol/L、53.07 μmol/L。

圖3 ROP潛在代謝標(biāo)志物的ROC曲線 谷氨酸與鳥(niǎo)氨酸對(duì)ROP的診斷價(jià)值最高。

表4 ROP潛在代謝標(biāo)志物的ROC曲線分析

3 討論

ROP是各種因素導(dǎo)致的微血管變性后新生血管增生性疾病，早產(chǎn)、低出生體重、過(guò)度用氧是公認(rèn)的危險(xiǎn)因素［6］。胎兒視網(wǎng)膜血管在16周左右開(kāi)始發(fā)育，直至足月才成熟。為了避免早產(chǎn)兒出生后未及時(shí)診斷及治療而導(dǎo)致視力受損甚至致盲的風(fēng)險(xiǎn)，在視網(wǎng)膜發(fā)育的過(guò)程中，需要定期檢查眼底了解血管生長(zhǎng)情況。由于技術(shù)和條件限制，部分地區(qū)甚至無(wú)法開(kāi)展ROP篩查。近年來(lái)隨著代謝組學(xué)和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展迅速，并逐漸應(yīng)用于各種疾病，如小兒哮喘、苯丙酮尿癥、先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥、新生兒支氣管肺發(fā)育不良等的早期識(shí)別、精準(zhǔn)診斷及個(gè)體化治療［7-10］。本研究對(duì)ROP患兒的血代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，以尋找可預(yù)測(cè)診斷ROP的生物標(biāo)志物。

Fu等［11］總結(jié)了ROP與代謝相關(guān)的研究，發(fā)現(xiàn)圍生期早期的代謝失調(diào)是ROP和其他早產(chǎn)兒遠(yuǎn)期并發(fā)癥的一個(gè)強(qiáng)有力但未被充分研究的危險(xiǎn)因素，說(shuō)明視網(wǎng)膜血管的生長(zhǎng)發(fā)育與機(jī)體代謝密切相關(guān)。Zhou等［12］對(duì)需要治療的ROP患兒與無(wú)需治療的ROP患兒的代謝物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)多個(gè)物質(zhì)的變化主要富集于蛋白質(zhì)消化吸收和氨基酰基-tRNA生物合成途徑。Nilsson等［13］對(duì)早產(chǎn)兒多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的代謝物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)兒低水平的1-磷酸鞘氨醇與嚴(yán)重ROP的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。另外，在新生小鼠的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，饑餓、高血糖狀態(tài)增加了視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡、減慢神經(jīng)元的生長(zhǎng)和促進(jìn)了視網(wǎng)膜新生血管的生長(zhǎng)［14-15］。本研究對(duì)早產(chǎn)兒ROP組及非ROP組的代謝情況進(jìn)行比較，結(jié)果顯示有5種差異代謝物即谷氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、鳥(niǎo)氨酸及甘氨酸，其中谷氨酸及鳥(niǎo)氨酸對(duì)ROP預(yù)測(cè)診斷價(jià)值最高，可以作為早期識(shí)別診斷ROP的生物標(biāo)志物，另外其可能在ROP疾病發(fā)展的過(guò)程中起到調(diào)節(jié)作用，需要更多動(dòng)態(tài)的代謝數(shù)據(jù)進(jìn)行研究及驗(yàn)證，有望通過(guò)營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)、改變機(jī)體代謝情況來(lái)調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜血管的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。

谷氨酸是一種酸性氨基酸，儲(chǔ)存于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、雙極細(xì)胞及光感受細(xì)胞神經(jīng)末梢的突觸囊泡內(nèi)，在視覺(jué)系統(tǒng)中有重要生理作用［16］。視網(wǎng)膜中多數(shù)興奮性信號(hào)由谷氨酸介導(dǎo)，但神經(jīng)突觸間隙中過(guò)量的谷氨酸可引起視網(wǎng)膜神經(jīng)元損傷甚至死亡［17］。已有多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)ROP患兒體內(nèi)谷氨酸水平升高且與ROP發(fā)生呈正相關(guān)，對(duì)ROP有良好的診斷價(jià)值［18-21］。本研究中ROP組患兒谷氨酸水平明顯高于非ROP組患兒，與既往研究［18-21］一致，提示高濃度的谷氨酸可能與ROP的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。ROC曲線分析提示谷氨酸對(duì)預(yù)測(cè)ROP的靈敏度及特異度高，可作為ROP早期預(yù)測(cè)標(biāo)志物或輔助診斷依據(jù)。

亮氨酸屬于支鏈氨基酸，是人體必需氨基酸之一。研究發(fā)現(xiàn)，富亮氨酸α-2糖蛋白1（leucinerich α-2-glycoprotein 1，LRG1），是一種富含亮氨酸的α-2-糖蛋白，它可以通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，參與異常血管生成的病理過(guò)程［22］。Mundo等［23］研究發(fā)現(xiàn) LRG1 在視網(wǎng)膜黃斑變性患者的血管內(nèi)皮細(xì)胞及脈絡(luò)膜新生血管膜周圍組織中的水平較高，結(jié)果支持了抗LRG1單克隆抗體成為治療新生血管相關(guān)視網(wǎng)膜病的候選治療靶點(diǎn)。另外，視網(wǎng)膜中富含亮氨酸的小蛋白多糖，在許多與纖維和血管生成有關(guān)的上游信號(hào)中發(fā)揮著重要作用，可調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、黏附、生長(zhǎng)和修復(fù)機(jī)制［24］。本研究發(fā)現(xiàn)ROP組患兒的亮氨酸水平明顯高于非ROP組患兒，提示ROP患兒視網(wǎng)膜的異常血管增殖可能與亮氨酸有關(guān)。

鳥(niǎo)氨酸是尿素循環(huán)的中心部分，可以促進(jìn)氨的排泄，天冬氨酸參與鳥(niǎo)氨酸循環(huán)。鳥(niǎo)氨酸-天冬氨酸被推薦為減少運(yùn)動(dòng)疲勞的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑之一［25］。但有研究發(fā)現(xiàn)高濃度的鳥(niǎo)氨酸對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞具有特異性毒性，長(zhǎng)期攝入過(guò)多鳥(niǎo)氨酸有視網(wǎng)膜病變風(fēng)險(xiǎn)［26］。本研究發(fā)現(xiàn)ROP組患兒鳥(niǎo)氨酸水平明顯高于非ROP組患兒，提示高濃度鳥(niǎo)氨酸可能增加了患兒視網(wǎng)膜病變風(fēng)險(xiǎn)。有一項(xiàng)多中心前瞻性隊(duì)列研究分析發(fā)現(xiàn)天冬氨酸的攝入量與增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生率有關(guān)［27］，但具體機(jī)制尚不清楚。本研究ROC曲線分析提示鳥(niǎo)氨酸對(duì)ROP的鑒別價(jià)值高，鳥(niǎo)氨酸可作為ROP早期預(yù)測(cè)診斷的代謝標(biāo)志物。

甘氨酸是一種非必需氨基酸，參與蛋白質(zhì)的合成和許多重要的生理功能。有研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸可以模擬血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子對(duì)視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，促進(jìn)體外和體內(nèi)血管生成，還能有效地保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體功能［28］。此外，甘氨酸可促進(jìn)血紅素的生物合成，血紅素在控制活性氧水平和維持氧化磷酸化中起關(guān)鍵作用，從而為血管增殖提供良好的環(huán)境［29-30］。最近有研究發(fā)現(xiàn)ROP患兒體內(nèi)甘氨酸水平升高［31］，本研究與之一致，提示甘氨酸可能與ROP患兒視網(wǎng)膜血管過(guò)度增殖有關(guān)。

綜上所述，本研究通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)和代謝組學(xué)方法比較了ROP患兒與非ROP患兒的血代謝產(chǎn)物，結(jié)果提示5種氨基酸存在明顯差異，是ROP的潛在標(biāo)志物，其中谷氨酸與鳥(niǎo)氨酸對(duì)ROP診斷價(jià)值最高，可以作為ROP早期診斷的生物標(biāo)志物，有助于ROP的早期識(shí)別與診斷。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。