張馳，鐘益梁，秦百君，陳鋒

1.廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011； 2.贛州市贛縣區(qū)人民醫(yī)院，江西 贛州 341100；3.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530200

退行性腰椎管狹窄癥(degenerative lumbar spinal stenosis，DLSS)是指由于關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)增生、椎間盤突出、黃韌帶肥厚(ligamentum flavum hypertrophy，LFH)等因素造成椎管及神經(jīng)根管狹窄，以腰腿痛、間歇性跛行為主要臨床表現(xiàn)的病癥。DLSS的綜合患病率為11%，隨著年齡的增長，DLSS患病率逐漸提升[1]。在我國人口老齡化發(fā)展態(tài)勢下，DLSS已成為導(dǎo)致中老年人腰腿痛、下肢無力、行動受限的常見骨科疾病[2]，對中老年人群的生活質(zhì)量影響較大。目前，臨床主要通過手術(shù)治療DLSS，但費用較昂貴，且手術(shù)存在一定的風險。治療DLSS的藥物以抗炎、鎮(zhèn)痛類為主，能在短期內(nèi)改善DLSS相關(guān)癥狀，但長期用藥會帶來不良反應(yīng)[3]。尋找安全有效的治療藥物并探討其作用機制成為DLSS研究中亟待解決的問題。

LFH在DLSS發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要地位，本課題組前期研究收集了核磁共振影像表現(xiàn)為LFH的DLSS病例[4]，術(shù)中摘取的黃韌帶組織病理學表現(xiàn)為彈力纖維顯著減少，排列紊亂，膠原纖維增多，呈現(xiàn)典型的纖維化改變[5]。中醫(yī)認為，纖維化疾病主要由于氣虛推動無力，血行滯澀，久而停積成瘀[6]。DLSS中醫(yī)臨床實踐指南將氣虛血瘀證列為DLSS的主要證候之一，治法為補氣活血、化瘀止痛，組方用補陽還五湯[3]。補陽還五湯在多種纖維化疾病中均表現(xiàn)出較好的抗纖維化作用[6]，體現(xiàn)了中醫(yī)學“異病同治”的特點，但由于成分復(fù)雜、作用靶點不明確，藥效分子機制仍需進一步研究。因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學聯(lián)合基因芯片與分子對接技術(shù)，初步研究補陽還五湯治療LFH的潛在分子機制。

1 資料與方法

1.1 篩選差異基因與疾病靶點從GEO數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ gds/)下載LFH相關(guān)的基因數(shù)據(jù)集GSE113212的矩陣和平臺注釋數(shù)據(jù)，該芯片數(shù)據(jù)來源于4份老年患者的LFH標本和4份年輕患者的非LFH標本。采用Perl 5.30.0軟件整理、注釋矩陣數(shù)據(jù)，采用R 4.1.2軟件的limma軟件包執(zhí)行差異分析，以logFC的絕對值>0.8且P<0.05篩選差異基因，并繪制火山圖和熱圖?；赨niprot數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)將LFH差異基因轉(zhuǎn)化為蛋白名，統(tǒng)一通用名稱，刪除非人源蛋白后作為LFH疾病靶點。

1.2 篩選補陽還五湯的有效成分和藥效靶點登陸中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)和SymMap數(shù)據(jù)庫(http：//www.symmap.org/)檢索黃芪、當歸、赤芍、地龍、川芎、紅花和桃仁的化合物成分，以口服生物利用度≥30%且類藥性≥0.18篩選補陽還五湯的有效成分，并收集藥效靶點，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫校對靶點蛋白，統(tǒng)一通用名稱，刪除非人源蛋白。

1.3 篩選補陽還五湯治療LFH的靶點采用Venny 2.1平臺將補陽還五湯藥效靶點與LFH疾病靶點取交集，獲得補陽還五湯治療LFH的靶點。并采用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建“中藥-化合物-靶點”可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.4 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)將補陽還五湯治療LFH的靶點輸入至String數(shù)據(jù)庫(https：//cn.string-db.org/)。以互作分數(shù)≥0.4作為篩選閾值，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。采用Cytoscape 3.7.0軟件的CytoNCA插件分析網(wǎng)絡(luò)中蛋白靶點的Closeness Centrality、Betweenness Centrality、Degree Centrality、Eigenvector Centrality、Local Average Connectivity-based method和Network Centrality共6個參數(shù)，計算中位值，將上述參數(shù)均>中位值的靶點判定為網(wǎng)絡(luò)中的核心蛋白[7]。

1.5 通路富集分析采用R 4.1.2軟件分析，以P<0.05篩選補陽還五湯治療LFH靶點的基因本體(gene ontology，GO)功能與京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路[8]，并將富集顯著性排名前10位的生物學進程、細胞組分、分子功能以及富集顯著性排名前40位的信號通路可視化展示。選取富集基因數(shù)不少于5個的信號通路，采用Cytoscape 3.7.0軟件的ClueGO和CluePedia插件聚類分析[9-10]，并通過可視化網(wǎng)絡(luò)展示通路上的靶點。

1.6 分子對接驗證化合物成分與靶點的結(jié)合關(guān)系從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載化合物成分的化學結(jié)構(gòu)，從PDB數(shù)據(jù)庫(https：//www.rcsb.org/)獲取靶點蛋白的結(jié)構(gòu)。采用Pymol 1.8.0軟件去除蛋白晶體的水分子、離子和配體后，將蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)入AutoDockTools 1.5.6軟件尋找活性口袋，蛋白和化合物文件經(jīng)格式轉(zhuǎn)換后通過AutoDock Vina軟件執(zhí)行分子對接模擬分析[11]，當結(jié)合能<-5.0 kcal·mol-1則判定為結(jié)合活性較好，結(jié)合能<-7.0 kcal·mol-1則判定為結(jié)合活性很強[12]。

2 結(jié)果

2.1 LFH的差異基因與疾病靶點共篩選出 1 851 個LFH的差異基因，其中有1 150個上調(diào)基因和701個下調(diào)基因，數(shù)據(jù)經(jīng)R 4.1.2軟件可視化展示排名前60位的差異基因熱圖(圖1A)及全部差異基因的火山圖(圖1B)。上述差異基因經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫校對，篩除非人源靶點后，得到1 659個LFH疾病靶點。

注：A為差異基因熱圖，B為差異基因火山圖，其中紅色、綠色和黑色條帶及點分別代表LFH組相對高表達、相對低表達和表達差異不顯著的基因

2.2 補陽還五湯治療LFH的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)根據(jù)口服生物利用度和類藥性篩選得到105個補陽還五湯的化合物成分，其中黃芪20個，當歸2個，赤芍29個，地龍2個，川芎7個，紅花22個，桃仁23個。共收集到264個補陽還五湯的藥效靶點，與1 659個LFH疾病靶點取交集后得到50個治療靶點(圖2)。經(jīng)整理歸納“中藥-化合物-靶點”關(guān)聯(lián)，最終得到補陽還五湯治療LFH的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中包含黃芪、當歸、赤芍、地龍、川芎、紅花和桃仁共7味中藥，涉及41種化合物成分，50個治療靶點(圖3)。

圖2 補陽還五湯藥效靶點與LFH疾病靶點韋恩圖

注：紅色線條代表中藥與化合物的關(guān)聯(lián)，藍色線條代表化合物與靶點的關(guān)聯(lián)

2.3 補陽還五湯治療LFH的靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)將50個治療靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫分析，通過Cytoscape 3.7.0軟件可視化，剔除游離靶點后，得到由47個蛋白組成的網(wǎng)絡(luò)，共有288條蛋白互作關(guān)系。根據(jù)6種參數(shù)的中位值篩選后得到14個核心蛋白靶點，分別為過氧化氫酶(catalase，CAT)、去乙酰化酶1(sirtuin1，SIRT1)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、細胞周期蛋白D1(cyclin D1，CCND1)、表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)、CTNNB1、CXCL8、白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、HIF1A、PPARG、IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、CAV1、IGFBP3(圖4)。

注：圖中橙色圓點代表核心蛋白靶點，紫色圓點代表普通蛋白靶點

2.4 補陽還五湯治療LFH靶點涉及的功能和通路GO功能富集分析共得到1 720條功能，其中生物學進程1 632條，包括成纖維細胞增殖的調(diào)節(jié)、慢性炎癥反應(yīng)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號的調(diào)節(jié)、細胞對TGF-β刺激的反應(yīng)等；細胞組分38條，包括纖維狀膠原三聚體、帶狀膠原纖維、含膠原細胞外基質(zhì)等；分子功能50條，包括生長因子結(jié)合、Smad綁定、信號受體激活劑活性等(圖5A)；KEGG通路富集分析結(jié)果包含104條通路，分別為叉頭轉(zhuǎn)錄因子(forkhead transcription factors of Oclass，F(xiàn)OXO)信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(phosphatei-dylinositol 3 kinase/serine-threonine kinase，PI3K/Akt)信號通路、Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(the Janus kinase/signal transducer and activator of tranions，JAK/STAT)信號通路、腺苷一磷酸激活蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphateactivated protein kinase，AMPK)信號通路等(圖5B)。進一步聚類分析將信號通路分為6個大類，F(xiàn)OXO信號通路作為其中一個大類，包含9個富集基因，分別為CAT、CCND1、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A)、EGFR、IL-10、IL-6、SIRT1、溶質(zhì)載體家族2成員4(solute carrier family 2 member 4，SLC2A4)、TGF-β1(圖6)。

圖5 補陽還五湯治療LFH靶點的功能和通路富集分析氣泡圖

注：三角形節(jié)點代表信號通路，每種顏色代表一個聚類組別；圓形節(jié)點代表富集在通路上的基因

2.5 補陽還五湯的化合物成分與FOXO信號通路靶點的結(jié)合活性從“中藥-化合物-靶點”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖3)中梳理富集在FOXO信號通路的9個靶點及相關(guān)聯(lián)的化合物成分，通過分子對接分析化合物與靶點的結(jié)合活性。由于PDB數(shù)據(jù)庫中未查到SLC2A4蛋白結(jié)構(gòu)，故無法對該蛋白執(zhí)行分子對接。17對“化合物-靶點”關(guān)聯(lián)均得到分子對接的驗證，具有較好的結(jié)合活性，其中TGF-β1、CDKN1A、EGFR、CAT、SIRT1與補陽還五湯化合物成分的結(jié)合活性很強(表1，圖7)。紅花、桃仁、當歸、赤芍的共有化合物成分beta-sitosterol與TGF-β1的結(jié)合活性是所有對接結(jié)果中最強的。

注：圖中央的棍棒結(jié)構(gòu)為化合物配體，周圍的螺旋條帶為蛋白結(jié)構(gòu)，展現(xiàn)了化合物配體與蛋白的分子對接空間構(gòu)象，每幅圖片上方文字標注為化合物配體與蛋白的名稱

表1 補陽還五湯的化合物成分與FOXO信號通路富集靶點的分子對接信息

3 討論

中醫(yī)將DLSS歸屬為“痹證”“腰腿痛”等范疇，病因主要為先天腎氣虧虛、后天脾虛運化無力。氣虛則督脈經(jīng)氣弱，腰脊失養(yǎng)，瘀血內(nèi)停，引發(fā)肌肉、韌帶、關(guān)節(jié)等退變失穩(wěn)，壓迫椎管及神經(jīng)根管引發(fā)腰腿痛、間歇性跛行等癥狀。糾正氣虛血瘀之因才能夠使督脈通達，脊柱氣血經(jīng)絡(luò)順暢，則血瘀病理產(chǎn)物得以疏散排出。補陽還五湯的組方應(yīng)用出自《醫(yī)林改錯》，功效為補氣活血通絡(luò)。本方重用生黃芪為君藥，甘溫補脾、肺之氣，氣為血之帥，故氣旺可促血行，瘀去則絡(luò)通。當歸尾為臣藥，活血通絡(luò)且不傷血。赤芍、桃仁、紅花、川芎為佐藥，助當歸尾活血祛瘀。地龍為佐使藥，其藥性力專善走，活絡(luò)通經(jīng)，引諸藥之力匯達絡(luò)中。臨床應(yīng)用補陽還五湯能夠顯著改善DLSS患者的疼痛癥狀，增加無痛行走距離[13-14]，降低血清炎癥因子水平[15-16]。王寶劍[17]認為，炎癥和纖維化是LFH的主要病理因素，在臨床樣本和動物模型的LFH組織中發(fā)現(xiàn)炎性因子 IL-1β、TNF和纖維化相關(guān)因子COL1A1、COL3A1高表達，通路關(guān)鍵節(jié)點TGF-β1、p-Smad2/3高表達。本研究分析發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯的化合物成分能夠直接作用于TNF、COL1A1、COL3A1和TGF-β1以及其他炎性因子IL-6、IL-10、MMP1等，其中TNF、TGF-β1、IL-6、IL-10為補陽還五湯治療LFH的核心蛋白靶點。臨床采用補陽還五湯加減聯(lián)合溫針灸治療DLSS能降低血清TNF和IL-6水平[15]，說明補陽還五湯具有一定的抗炎作用。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)補陽還五湯治療LFH的靶點富集在FOXO信號通路、PI3K/Akt信號通路等。其中，去乙酰化酶SIRT1為補陽還五湯治療LFH的核心蛋白靶點，在FOXO信號通路的乙?；{(diào)控機制中占有重要地位，其能夠?qū)⑥D(zhuǎn)錄因子FOXO去乙?；?，從而促進下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。心肌肥厚大鼠模型的研究證實，肥厚的心肌組織中SIRT1表達降低，F(xiàn)OXO1乙?；揭约癟NF、IL-1β、IL-6、COL1A1、α-SMA蛋白表達增高，姜黃素和葛根素能夠通過上調(diào)SIRT1抑制心肌纖維化和炎癥反應(yīng)，從而改善心肌肥厚和心臟功能，而SIRT1抑制劑能夠逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)[18-19]。心肌肥厚與LFH的病理特點相類似，本研究的基因芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)LFH組的SIRT1呈現(xiàn)異常低表達(logFC=-1.032，P=0.011)，分子對接結(jié)果中補陽還五湯的化合物成分formononetin與SIRT1的結(jié)合能力很強，且已有實驗證實formononetin可通過激活SIRT1抑制炎癥和纖維化表型[20-21]，故formononetin可能通過SIRT1/FOXO軸調(diào)控炎癥與纖維化而發(fā)揮治療LFH的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，CCND1為補陽還五湯治療LFH的核心蛋白靶點，它與CDKN1A均為FOXO信號通路下游細胞周期相關(guān)的靶基因。我們通過基因芯片發(fā)現(xiàn)，LFH組的CCND1(logFC=1.001，P=0.006)和CDKN1A(logFC=1.016，P=0.003)呈現(xiàn)異常高表達。Gang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，CDKN1A在人類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織和成纖維細胞樣滑膜細胞中呈現(xiàn)異常低表達，過表達CDKN1A能顯著抑制該細胞的增殖和侵襲，并使細胞周期停滯在G0/G1期，同時下調(diào)TNF、IL-6的表達，上調(diào)IL-10的表達。上述結(jié)果與我們研究的LFH芯片表達結(jié)果相反，黃韌帶成纖維細胞中CDKN1A的功能有待新的實驗進一步論證。成纖維細胞為人體黃韌帶的主要效應(yīng)細胞，能夠分泌膠原纖維和彈性纖維。在椎間盤退變、椎體序列不穩(wěn)等因素產(chǎn)生的異常機械應(yīng)力下，黃韌帶組織微損傷誘導(dǎo)瘢痕修復(fù)、炎癥細胞浸潤，炎性因子刺激膠原分泌型成纖維細胞增殖，黃韌帶中膠原纖維比例增多最終誘發(fā)LFH。魯齊林[23]研究發(fā)現(xiàn)，在外源性炎癥因子MIF刺激下，黃韌帶成纖維細胞周期分布中S期顯著增加，且CCND1表達升高，說明細胞增殖水平增加；成纖維細胞TGF-β1、MMP13、IL-1β、IL-6、TNF、COL1A1、COL3A1表達增加，說明炎癥水平和膠原表達水平增加，Rho途徑是該過程的中間環(huán)節(jié)，在膝關(guān)節(jié)囊成纖維細胞的體外研究中亦得出了相似的結(jié)論[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯的多個化合物成分與CCND1、CDKN1A有較好的結(jié)合活性，進一步說明補陽還五湯多成分、多靶點的復(fù)雜調(diào)控特點，可能通過調(diào)控成纖維細胞增殖治療LFH。關(guān)于FOXO的上游調(diào)控機制，p-Akt能夠促進FOXO1、FOXO3a磷酸化并使其進入泛素化降解進程，從而負性調(diào)控FOXO的轉(zhuǎn)錄活性[26-27]。此外，JAK/STAT信號通路[28]、AMPK信號通路[29]均為FOXO的上游調(diào)控途徑，在LFH的研究中有待于進一步探討。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學聯(lián)合基因芯片技術(shù)尋找補陽還五湯治療LFH的靶點，通過功能與通路富集分析、分子對接技術(shù)，結(jié)合相關(guān)文獻證據(jù)，初步發(fā)現(xiàn)補陽還五湯可能通過FOXO信號通路、PI3K/Akt信號通路和AMPK信號通路調(diào)控成纖維細胞增殖、炎癥和膠原合成，治療LFH從而改善DLSS的疾病進程。本研究結(jié)果能夠為進一步分析補陽還五湯治療LFH的分子機制提供方向。