王永強， 姚夢楠， 薛 冬， 趙 娜， 周恩強， 魏利斌， 顧春燕， 繆亞梅， 汪凱華， 王學(xué)軍

(江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇南通 226001)

澇害是指土壤水分含量超過植物正常生長需要時對植物產(chǎn)生的直接危害及次級危害。我國屬于季風氣候區(qū)，降水相對集中于夏季。一方面，濕潤的季風帶來充足的降水，有利于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)；但另一方面，過于集中的降水容易產(chǎn)生澇害。大豆耐澇性較差，強降水容易導(dǎo)致種子處于缺氧狀態(tài)，形成爛?；虿徽Ｃ?。研究大豆種質(zhì)耐澇性對我國農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

大豆在整個生育期都有可能遭遇澇害影響。在苗期遭遇澇害，大豆出現(xiàn)葉色黃化，阻礙根部發(fā)育生長，導(dǎo)致根系活力降低[1]。有研究表明，苗期澇害逆境時間越長，對大豆生長影響傷害越大[2-3]。Scott等對V1期[4]、董鉆對V1、V4期[5]、Githiri 等對V3期[6]、Oosterhuis等對V4期[7]、Shannon等對R1期[8]、VanToai等對R1～R4期[9]、Isism對R2期[10]大豆的耐澇性進行研究，發(fā)現(xiàn)在相同澇害時間條件下，生殖生長時期遭遇澇害對大豆生長及其產(chǎn)量的影響顯著高于營養(yǎng)生長時期。宋曉慧等以耐澇品種墾豐14和不耐澇品種墾豐16為試材，研究不同淹水脅迫時間對大豆苗期根部形態(tài)和生理指標的影響，發(fā)現(xiàn)短時間脅迫下，根瘤數(shù)、電導(dǎo)率、丙二醛和脯氨酸含量變化無明顯差異；隨著脅迫時間增加，耐澇品種根瘤生長受抑制程度小于不耐澇品種，不耐澇品種的不定根數(shù)量、電導(dǎo)率、丙二醛含量較耐澇品種均增加[11]。目前，對于大豆耐澇的研究主要集中于苗期、營養(yǎng)生長期及生殖生長期。本研究通過對不同大豆種質(zhì)48、72 h浸水處理，研究大豆種質(zhì)理化特性、發(fā)芽活力指數(shù)等變化規(guī)律，以期為解釋大豆種質(zhì)萌發(fā)期的耐澇性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

10份大豆種質(zhì)資源為江蘇省區(qū)域試驗收集所得，2020年種植于江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，于當年收獲種子。

1.2 試驗設(shè)計

大豆種子發(fā)芽率檢測：10份大豆種質(zhì)材料2020年收獲新種子，25 ℃下進行標準發(fā)芽試驗，重復(fù)3次，檢測試驗材料發(fā)芽率。

種子長度、寬度測定：取100粒種子置于種子掃描儀上，利用分析軟件計算出種子平均長度與寬度值。

種子蛋白、油分含量測定：取100粒種子導(dǎo)入近紅外光譜儀盒中，重復(fù)3次，繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線讀取蛋白含量和油分含量值。

種子浸水處理、電導(dǎo)率測定：選取正常、無種皮破裂大豆種子600粒，浸于75%乙醇中消毒5 s，取出后用去離子水清洗干凈曬干。25 ℃下，取100粒放入燒杯中，加入400 mL去離子水浸泡48 h，重復(fù)3次，為T1處理；另外300粒分3次重復(fù)加 400 mL 去離子水浸泡72 h，為T2處理。用DS-1型電導(dǎo)率儀測定浸泡液的電導(dǎo)率。

T1、T2處理下種子發(fā)芽率及根長、苗長測定：實驗室內(nèi)浸水48 h(T1)、72 h(T2)后，進行標準發(fā)芽試驗，種子發(fā)芽率計算辦法參照尹燕枰等紙間發(fā)芽法[12]。發(fā)芽紙經(jīng)滅菌消毒后，在去離子水中充分浸泡，取200粒種子經(jīng)75%乙醇消毒后用去離子水洗凈，整齊擺放在發(fā)芽紙上，然后覆蓋上另外1張發(fā)芽紙，疏松卷起，豎直放入自封袋中，25 ℃下光照發(fā)芽7 d，統(tǒng)計發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、種苗生長量。

發(fā)芽活力指數(shù)=種苗生長量×發(fā)芽指數(shù)；

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt。式中，Gt為時間t的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

超氧化物歧化酶(SOD)活性測定：采用李合生的氮藍四唑(NBT)比色法[13]。

丙二醛(MDA)含量測定：參照趙世杰等雙組分分光光度計法[14]。

丙酮酸脫羧酶(PDC)活性測定：PDC活性測定采用試劑盒(Boxbio公司提供)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2003、SPSS軟件進行統(tǒng)計分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種質(zhì)材料種子的理化特性

不同種質(zhì)材料種子的理化特性見表1。華科7號種子長度最長，為8.78 cm；蘇X19011種子長度最短，為7.86 cm。種子長度在8.50 cm及其以上的材料占比50%。徐豆24種子寬度最寬，為 7.00 cm。種子寬度超過6.50 cm的材料占比60%。通豆16-058蛋白含量最高，為46.00%；蘇X19011蛋白含量最低，為41.80%。蛋白含量超過44.00%材料占比50%。南農(nóng)W182油分含量最高，為18.80%；蘇SN18油分含量最低，為17.00%。油分含量超過18.00%的材料占比60%。各材料之間差異顯著，利于試驗研究。

表1 不同種質(zhì)材料種子的理化特性

2.2 不同時間處理種質(zhì)相對電導(dǎo)率

相對電導(dǎo)率反映細胞膜的完整性，相對電導(dǎo)率高低反映種子的活力水平[2]。不同浸水時間處理下的相對電導(dǎo)率見圖1。T1處理下，各材料之間相對電導(dǎo)率表現(xiàn)差異顯著。8號材料相對電導(dǎo)率最低，為0.18；浸水48 h，細胞膜較完整，內(nèi)含物質(zhì)流出較少。3號材料相對電導(dǎo)率最高，為0.38；種子內(nèi)部內(nèi)含物質(zhì)流出較多，細胞膜傷害較大。隨著浸水時間延長，相較于T1處理，各材料相對電導(dǎo)率顯著增加。T2處理下，3號材料相對電導(dǎo)率最高，為0.50；7號材料次之，為0.48；8號材料相對電導(dǎo)率最低，為0.24。

2.3 不同時間處理種質(zhì)發(fā)芽活力指數(shù)表現(xiàn)

不同種質(zhì)材料T1、T2處理下的發(fā)芽率、根長、苗長、發(fā)芽活力指數(shù)統(tǒng)計結(jié)果見表2。各材料之間標準發(fā)芽率均在95%以上，無顯著差異，說明種子質(zhì)量良好。不同種質(zhì)材料在T1、T2處理下的發(fā)芽率、根長、苗長、發(fā)芽活力指數(shù)差異顯著。T1處理下，除了4、8號材料浸水發(fā)芽率較高，均為96%，其余各材料均明顯低于標準發(fā)芽率；3號材料浸水發(fā)芽率為0，7號材料浸水發(fā)芽率為4%，表明3、7號材料受澇害傷害較大。T2處理下，隨著浸水時間延長，除2、8號材料外，其余各材料浸水發(fā)芽率均明顯降低，其中6號材料變化最為明顯，浸水發(fā)芽率由70%降低至6%。T1處理下，2號材料根長最長，為14.8 cm；4號材料苗長最長，為13.3 cm。T2處理下，隨著浸水時間延長，2、8號材料根長、苗長增加，1號根長伸長外，其余各材料降低。浸水脅迫對2、8號材料種質(zhì)無明顯影響，對其余種質(zhì)影響較大。T1處理下，8號材料發(fā)芽活力指數(shù)最高，為25.7；3號材料發(fā)芽活力指數(shù)最低，為0。T2處理下，隨著浸水時間延長，除2、8號發(fā)芽活力指數(shù)增加外，其余材料均降低；其中10號材料發(fā)芽活力指數(shù)降低最明顯，說明該處理時間的澇害逆境對材料傷害最大。

表2 不同時間處理大豆種質(zhì)發(fā)芽活力指數(shù)

2.4 不同時間處理種質(zhì)SOD活性、MDA含量變化

超氧化物歧化酶是抵抗逆境的酶，植物體內(nèi)超氧化物歧化酶活性增加，抵抗逆境傷害能力增強。丙二醛是植物遭受傷害產(chǎn)生的有害物質(zhì)，其含量高低反映植物膜脂過氧化程度[15]。T1、T2處理下不同種質(zhì)材料SOD活性、MDA含量變化如圖2所示。T1處理下，不同材料之間SOD活性差異明顯。4號材料SOD活性最高，為9.3 U/g，抵抗逆境能力較強。3號材料SOD活性最低，為3.2 U/g，抵抗逆境能力較低。T2處理下，隨著浸水時間延長，除2、7、8號材料的SOD活性無明顯變化外，其余材料的SOD活性明顯降低，說明浸水脅迫對SOD活性起到抑制作用。T1處理下，不同種質(zhì)材料MDA含量差異顯著。6號材料MDA含量最高，為219.1 nmol/g，可能與SOD活性較高、清除自由氧能力較強有關(guān)。8號材料MDA含量最低，為 103.8 nmol/g。T2處理下，隨著浸水時間延長，各材料MDA含量明顯高于T1處理。說明隨著浸水脅迫時間延長，細胞內(nèi)部膜脂過氧化程度越來越高，SOD活性只能在一定程度上清除自由氧，超過一定限度，MDA含量會增加，對種子產(chǎn)生毒害作用，從而逐步導(dǎo)致種子喪失活力。

2.5 T1處理下不同種質(zhì)材料丙酮酸脫羧酶活性變化

丙酮酸脫羧酶是無氧呼吸關(guān)鍵酶。種子在遭受澇害時，測定PDC活性對解釋耐澇機制具有重要意義。有研究表明，植物通過降低無氧呼吸速率來抵抗?jié)澈δ婢砙16]。T1處理下，丙酮酸脫羧酶活性見圖3。不同材料之間PDC活性差異明顯，其中2號材料PDC活性最低，為3.1 μmol/(min·g)；其次為8號材料，為3.3 μmol/(min·g)。3號材料PDC活性最強，為5.9 μmol/(min·g)；其次為7號材料，為4.9 μmol/(min·g)。

2.6 不同時間處理各觀測性狀相關(guān)性

各觀測性狀相關(guān)性如表3所示。種子長度與相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、丙酮酸脫羧酶活性呈顯著正相關(guān)，與超氧化物歧化酶活性、發(fā)芽活力指數(shù)呈顯著或極顯著負相關(guān)。種子長度越長，相對電導(dǎo)率越高，丙二醛含量越高，丙酮酸脫羧酶活性越高，超氧化物歧化酶活性越低，發(fā)芽活力指數(shù)越低，導(dǎo)致種子抵抗?jié)澈δ婢衬芰υ讲?。蛋白含量與種子相對電導(dǎo)率呈顯著正相關(guān)。相對電導(dǎo)率與種子發(fā)芽活力指數(shù)呈顯著或極顯著負相關(guān)。種子在浸泡過程中，種子內(nèi)含物質(zhì)流出越多，種子受傷害程度越大，種子相對電導(dǎo)率越高，種子發(fā)芽活力指數(shù)越低。T1處理下，相對電導(dǎo)率與超氧化物歧化酶活性呈顯著負相關(guān)。T2處理下，相對電導(dǎo)率與丙二醛含量、丙酮酸脫羧酶活性呈顯著正相關(guān)。超氧化物歧化酶活性與丙二醛含量呈顯著或極顯著負相關(guān)，與種子發(fā)芽活力指數(shù)呈顯著正相關(guān)。超氧化物歧化酶活性越高，丙二醛含量越低，種質(zhì)發(fā)芽活力指數(shù)越高。丙二醛含量與種子發(fā)芽活力指數(shù)呈顯著或極顯著負相關(guān)。丙酮酸脫羧酶活性與種子發(fā)芽活力指數(shù)呈顯著或極顯著負相關(guān)。種子在澇害狀態(tài)下，丙酮酸脫羧酶活性越高，無氧呼吸速率較高，產(chǎn)生較多有害物質(zhì)，對種子產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致種子發(fā)芽活力指數(shù)降低。耐澇性強的種質(zhì)，如8號材料，通過提高超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛含量、丙酮酸脫羧酶活性、無氧呼吸速率，來抵抗環(huán)境澇害逆境。

表3 各觀測性狀相關(guān)性

3 討論

溫度、浸水時間顯著影響種質(zhì)的耐澇性[17]。種子萌發(fā)過程中，溫度過高，會加快無氧呼吸速度，種子內(nèi)部積累大量乙醇，對種子產(chǎn)生毒害作用，從而影響種子萌發(fā)[18-20]。陳文杰等以種子浸水12～68 h 為時間處理梯度，發(fā)現(xiàn)隨著浸水時間的延長，大豆浸泡液電導(dǎo)率不斷增加，發(fā)芽勢、出苗率、正常苗率逐漸降低[17]。Ali等建議以浸水48 h后大豆苗長為指標，研究大豆耐浸水能力[18]。Hou等在 25 ℃ 下對730份大豆材料進行種子淹水處理，發(fā)現(xiàn)一些種子淹水2 d就喪失活力，而一些種子淹水 4 d 還保持較高的發(fā)芽率[19]。陳文杰等還對南方大豆種質(zhì)耐浸水能力進行了鑒定與分析，篩選出耐浸水能力較好的抗性品種[20]。Hou等研究結(jié)果表明，溫度從15 ℃提高到30 ℃時，種子無氧呼吸速率明顯變快，浸水后96 h便失去發(fā)芽率[21]。本試驗中，通過前期種質(zhì)資源篩選和預(yù)試驗，確定試驗溫度為25 ℃，處理時間為48、72 h時，不同種質(zhì)之間理化特性差異較大，可以更好地解釋種質(zhì)在澇害條件下抵抗?jié)澈Φ睦砘瘷C制。

植物在遭受澇害條件下，體內(nèi)的氧會被活化成對細胞有傷害的活性氧。耐澇性較強的品種在淹水脅迫下可以誘導(dǎo)或者保持較高的抗氧化酶活性，清除活性氧陰離子自由基，防止細胞膜系統(tǒng)被破壞，從而保持細胞膜系統(tǒng)活力[22-25]。MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，可與細胞膜上的蛋白質(zhì)、酶等結(jié)合，使細胞失活[26-28]。周琴等研究表明，淹水時間越長，大豆MDA含量越高[3]，這和本研究結(jié)果一致。本試驗發(fā)現(xiàn)，不同大豆種質(zhì)的SOD活性、MDA含量差異明顯，呈顯著負相關(guān)。耐澇性強的種質(zhì)SOD活性顯著高于澇害敏感型材料，而丙二醛含量較敏感型低，這和前人研究結(jié)果[15]一致。隨著浸水時間延長，抗性品種SOD活性并沒有顯著增加，澇害敏感型品種SOD活性降低，說明植物抵抗?jié)澈δ婢衬芰赡苡幸欢ǚ秶?。而丙二醛含量不斷增加，說明種質(zhì)膜脂過氧化程度隨著浸水時間延長不斷增加。

有研究表明，植物在澇害條件下，可以通過“靜止策略”降低能量消耗來應(yīng)對缺氧狀態(tài)，如耐澇水稻種質(zhì)FR13A[29]。耐浸水大豆材料Peking在缺氧條件下不發(fā)芽，在氧氣正常時恢復(fù)發(fā)芽，也是通過“靜止策略”實現(xiàn)耐浸水；相反一些不耐浸水材料則在缺氧條件下依然發(fā)芽，無氧呼吸產(chǎn)生有害物質(zhì)導(dǎo)致種子活力降低[30-31]。本研究中，T1處理下，PDC活性與發(fā)芽活力指數(shù)之間呈極顯著相關(guān)性，而強耐澇性種質(zhì)的丙酮酸羧化酶活性較低，弱耐澇性種質(zhì)的丙酮酸羧化酶活性較高，說明在萌發(fā)期，種質(zhì)通過降低無氧呼吸速率來抵抗?jié)澈δ婢?，而該時期其他抗逆方式有待進一步研究。

4 結(jié)論

大豆浸水48、72 h后，不同種質(zhì)之間的發(fā)芽活力指數(shù)、相對電導(dǎo)率、超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量、丙酮酸脫羧酶活性差異顯著。隨著浸水脅迫時間增加，蘇X19011、新豆90-30的發(fā)芽活力指數(shù)無明顯變化，其余各材料均明顯降低；蘇X19011的發(fā)芽活力指數(shù)最高，為27.6；通豆16-058、南農(nóng)W182的發(fā)芽活力指數(shù)為0?？剐苑N質(zhì)通過提高SOD活性、降低丙酮酸脫羧酶活性和丙二醛含量來抵抗?jié)澈δ婢场?/p>