許 玲，于文娟，董喬娟，于盼盼，姜明慧，白秀彬，趙紀(jì)文

（山東扳倒井股份有限公司，山東高青 256300）

中國白酒釀造產(chǎn)區(qū)生態(tài)環(huán)境各異，微生態(tài)各不相同，進(jìn)而導(dǎo)致白酒品種繁多、香型各異[1]。醬香型白酒作為中國白酒的傳統(tǒng)典型酒種之一，具有高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒、長期貯存的“四高一長”工藝特點(diǎn)[2]。獨(dú)特的釀造工藝對(duì)質(zhì)量風(fēng)格有著至關(guān)重要的影響，微生物區(qū)系的形成及其生態(tài)功能的發(fā)揮又是關(guān)鍵所在。堆積發(fā)酵是醬香型白酒獨(dú)有的生產(chǎn)工藝，該過程的主要作用是網(wǎng)羅堆積場地和空氣中的微生物，生成多種酶類，在多種酶類的相互作用下合成酒體的前驅(qū)物質(zhì)及香味物質(zhì)[3-5]。

酵母菌和霉菌在醬香白酒釀造過程中發(fā)揮著巨大作用[2]，酵母是產(chǎn)乙醇和重要風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)鍵微生物，霉菌能夠分泌多種酶類，對(duì)釀造原料降解和中國白酒風(fēng)味的形成有重要貢獻(xiàn)[6]。

本研究應(yīng)用Illumina Miseq 高通量測序技術(shù)，以醬香型白酒各輪次堆積酒醅為研究對(duì)象，針對(duì)不同輪次堆積酒醅的真菌菌群結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行對(duì)比研究，分析醬香型白酒酒醅堆積過程中真菌變化，探究各輪次高溫堆積階段的主要優(yōu)勢菌群動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為優(yōu)化利用釀酒微生物資源和生產(chǎn)質(zhì)量控制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

酒醅：取自山東扳倒井股份有限公司白酒釀造車間醬香型白酒堆積酒醅。

儀器設(shè)備：Illumina Miseq 2×300 bp 高通量測序平臺(tái)，生工生物工程上海股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 取樣方法

樣品采自山東扳倒井股份有限公司7 個(gè)不同輪次醬香堆積發(fā)酵后的酒醅，每堆酒醅采樣按照升溫情況，在中軸斷面分為五個(gè)層次，每個(gè)層次分別取樣，取樣時(shí)在每個(gè)溫度層的所有位置均勻取樣，最后將五個(gè)層次的樣品混合，四分法取樣，即可代表本輪次堆積酒醅。每輪次樣品采集完后及時(shí)將樣品轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱密封保存。

1.2.2 高通量測序分析方法

生工生物工程上海股份有限公司利用Illumina Miseq 2×300 bp 高通量測序平臺(tái)測序。將檢測后合格的基因組DNA稀釋作為模板。

真菌擴(kuò)增區(qū)域?yàn)镮TS1—ITS2；細(xì)菌PCR 擴(kuò)增采用16S V3—V4 可變區(qū)的引物，古菌擴(kuò)增V3—V4區(qū)，采用的是巢式PCR。擴(kuò)增序列通過Illumina Miseq 2×300 bp 高通量測序平臺(tái)進(jìn)行測序，下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過cutadapt（去除接頭）、PEAR(序列對(duì)拼)、Prinseq (質(zhì)量剪切），去除得分低于20 分、堿基模糊、引物錯(cuò)配或測序長度小于150 bp的序列。

經(jīng)過上述步驟，將標(biāo)簽分組具有97 %序列相似性的高質(zhì)量OTU 序列，真菌得到的OTU 代表序列比對(duì)RDP 數(shù)據(jù)庫和UNITE 數(shù)據(jù)庫；細(xì)菌和古菌得到的每個(gè)OTU 代表序列比對(duì)RDP 數(shù)據(jù)庫、silva數(shù)據(jù)庫和NCBI 16S 數(shù)據(jù)庫。最后通過人工進(jìn)行檢查以獲得物種信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性分析

2.1.1 基于可操作分類單元聚類分析

利用MiSeq 平臺(tái)的擴(kuò)增子測序技術(shù)分析扳倒井醬香型白酒各輪次堆積酒醅真菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性及演替規(guī)律。應(yīng)用稀釋曲線測序數(shù)據(jù)量可表征樣本中物種的豐富度、均一性或多樣性，并說明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理[7]；Shannon 指數(shù)曲線可反映樣本微生物多樣性[8]。圖1 表明，本研究每個(gè)樣本的序列數(shù)均超過了22000，樣本的稀釋曲線與Shannon 指數(shù)曲線均趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)微生物的多樣性信息。

圖1 樣品真菌的稀釋曲線和Shannon指數(shù)曲線

2.1.2 α-多樣性分析

α-多樣性分析可揭示堆積酒醅中微生物群落的豐富度和多樣性。計(jì)算Shannon 指數(shù)、Simpson指數(shù)、ACE 指數(shù)、Chao 指數(shù)和覆蓋率，以描述樣本中真菌菌群的多樣性[9]。

由表1 可知，不同輪次的堆積酒醅在97%水平下共得到真菌OTU 數(shù)為381，下沙輪次樣本中的OTU 數(shù)最高為147，五輪次為21，是全年樣本中OTU 數(shù)最低的。Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)、Chao指數(shù)和ACE 指數(shù)表明，下沙輪次堆積酒醅的真菌多樣性和豐富度明顯高于其他輪次，說明下沙輪次的堆積環(huán)境有利于真菌的繁殖；五輪次堆積酒醅的真菌多樣性和豐富度低于其他輪次，可見隨著一輪輪發(fā)酵酒醅環(huán)境越來越不適合真菌的繁殖。各個(gè)樣本的覆蓋率都在0.9990 以上，說明各樣品文庫的覆蓋率足夠大，絕大部分的微生物都被檢測到，測序結(jié)果充分體現(xiàn)了國井綿雅醬香白酒堆積酒醅真菌群落多樣性的真實(shí)情況。

表1 樣本真菌群落多樣性指數(shù)

2.2 堆積酒醅真菌群落組成分析

基于Illumina MiSeq 測序數(shù)據(jù)對(duì)國井醬香型白酒各輪次堆積酒醅中真菌的ITS1-ITS2 區(qū)序列進(jìn)行分析，研究各輪次堆積酒醅真菌物種和群落結(jié)構(gòu)，圖2 為各輪次堆積酒醅樣本在門水平上的真菌群落結(jié)構(gòu)組成。

圖2 不同輪次堆積酒醅真菌群落結(jié)構(gòu)（門水平）

從圖2 可知，堆積酒醅采集的樣品中共檢出4個(gè)門類。Ascomycota（子囊菌門）為第一優(yōu)勢菌門，各輪次占菌群相對(duì)豐度的90 %以上，在五輪次時(shí)達(dá)到最大值，占菌群相對(duì)豐度的99.99%。Basidiomycota（擔(dān)子菌門）為第二優(yōu)勢菌門，幾乎只存在于下沙階段，說明這些Basidiomycota（擔(dān)子菌門）可能主要來自于該輪次用的大曲、原輔料或者當(dāng)時(shí)環(huán)境中。以上結(jié)果與已報(bào)道的醬香型白酒堆積酒醅及大曲微生物在門類結(jié)構(gòu)上的研究具有相似性，孫利林[10]對(duì)醬香型白酒第四輪次酒釀造堆積酒醅研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)最主要的是Ascomycota（子囊菌門）；李申奧[11]對(duì)兼香型白酒高溫大曲微生物研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)Ascomycota（子囊菌門）為優(yōu)勢菌門；Hu[12]研究白云邊酒高溫大曲微生物發(fā)現(xiàn)，真菌主要為Ascomycota（子囊菌門）、Unclassfied Fungi，其中Ascomycota（子囊菌門）為優(yōu)勢菌門。

從圖3 可知，扳倒井醬香型白酒堆積酒醅樣品中共檢出25 個(gè)真菌菌屬。其中Issatchenkia（伊薩酵母屬）、Thermomyces（嗜熱真菌屬）、Aspergillus（曲霉屬）和Pichia（畢赤酵母屬）各輪次都可檢出且為優(yōu)勢菌屬。Issatchenkia（伊薩酵母屬）在各輪次中均占50 %以上，五輪次占比高達(dá)96 %；Dipodascus（雙足囊菌屬）僅在下沙和糙沙輪次檢出，占比分別為19.59 %和0.13 %；Thermomyces（嗜熱真菌屬）在一輪次和二輪次占比較大，分別為12.88%和17.56 %；Pichia（畢赤酵母屬）在二輪次占比較大，為19.03%；Zygosaccharomyces（接合酵母屬）僅存在于四輪次，占比為2.38%。

圖3 不同輪次堆積酒醅真菌群落結(jié)構(gòu)（屬水平）

Issatchenkia（伊薩酵母屬）產(chǎn)乙酸乙酯能力強(qiáng),具有耐高溫、耐酒精度等特性；Thermomyces（嗜熱真菌屬）大多能產(chǎn)生具有高活力和熱穩(wěn)定性的纖維素酶、蛋白酶等，對(duì)降解高分子多糖和蛋白質(zhì)具有促進(jìn)作用，有利于釀酒原料被微生物利用，起到促進(jìn)微生物生長繁殖以及產(chǎn)酒生香的作用；曲霉屬（Aspergillus）可利用醬香型白酒偏酸性的釀造環(huán)境分泌酸性水解酶類，如酸性淀粉酶、酸性蛋白酶等，分解原料中的淀粉與蛋白質(zhì)，為發(fā)酵提供持續(xù)性的動(dòng)力[13]；蔡雪梅等[14]的研究發(fā)現(xiàn)一株P(guān)ichia kudriavzevii（庫德里阿茲氏畢赤酵母）可以產(chǎn)生多達(dá)64 種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，可作為白酒生香酵母。

3 結(jié)論

本研究使用高通量測序技術(shù)對(duì)堆積酒醅樣品中的微生物進(jìn)行了分析研究。結(jié)果表明，各輪次堆積酒醅共檢出4 個(gè)真菌門類，Ascomycota（子囊菌門）為第一優(yōu)勢菌門；共檢出25 個(gè)真菌菌屬，Issatchenkia（伊薩酵母屬）、Thermomyces（嗜熱真菌屬）、Aspergillus（曲霉屬）和Pichia（畢赤酵母屬）在各輪次都可檢出且為優(yōu)勢菌屬。對(duì)比各輪次的檢測結(jié)果，下沙輪次堆積酒醅的真菌多樣性和豐富度最好，五輪次堆積酒醅的真菌多樣性和豐富度最差。