邵春山，余祖華，廖成水，賈艷艷，李 靜，魏 穎，李元曉，曹平華，何萬領(lǐng)，趙龍妹，李 旺，丁 軻，*

（1.河南科技大學(xué)功能微生物與精準(zhǔn)營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽 471003；2.洛陽市活載體生物材料與動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽 471003）

嘔吐毒素主要是由雪腐鐮刀菌、禾谷鐮刀菌等真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物（Yue等，2021）。農(nóng)作物采收期間受到惡劣天氣影響或者谷物儲(chǔ)存不當(dāng)?shù)拳h(huán)境原因，致使真菌生長繁殖分泌霉菌毒素（Eriksen等，2021）。DON污染的農(nóng)作物流入市場(chǎng)用于加工食品和飼料，會(huì)引發(fā)公共衛(wèi)生安全隱患。動(dòng)物采食被DON污染地飼料之后，身體會(huì)出現(xiàn)各種不良反應(yīng)如嘔吐、厭食癥和營養(yǎng)不良等臨床癥狀（Yue等，2021；Kang等，2019），并且還會(huì)造成消化系統(tǒng)紊亂。研究表明豬日糧含DON 8μg/kg飼養(yǎng)21 d后，豬腸上皮細(xì)胞造成氧化應(yīng)激（Shen等，2021）。肝臟是動(dòng)物體內(nèi)最主要的解毒器官，有研究報(bào)道小鼠日糧中添加DON會(huì)引起小鼠肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性（Meng等，2021）。DON還會(huì)影響雄性動(dòng)物前列腺類固醇的生成，導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)仔能力下降（Urbanek等，2021）。

為減少DON對(duì)動(dòng)物和人的危害，人們使用各種降解DON的方法，目前主要有物理降解法、化學(xué)降解法和生物降解法。物理降解法和化學(xué)降解法較早用于降解飼料和食品中的DON，雖卓有成效但也有不盡人意之處（Yao和Long，2020）。有研究報(bào)道從海水中分離出耐鹽遠(yuǎn)洋桿菌DON降解率為81%（Zhang等，2020）。運(yùn)用微生物降解飼料和食物中DON是備受關(guān)注的方法，其中益生菌降解飼料和食品中的DON是最理想的方式（Franco等，2011）。

本研究從普洱茶茶葉中分離出一株畢赤酵母菌MC-1，通過研究其特性，為降解動(dòng)物飼料中DON的菌株選擇提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑 酶標(biāo)儀，4℃離心機(jī)，超聲波破碎儀，紫外可見分光光度計(jì)，PCR擴(kuò)增儀，凝膠成像系統(tǒng)，DON ELISA檢測(cè)試劑盒（北京華安麥科生物科技有限公司），DON標(biāo)準(zhǔn)品（天津一方科技有限公司），細(xì)菌基因組提取提取試劑盒（北京天根），牛膽鹽，胰蛋白酶，胃蛋白酶。

1.2 樣品來源 陳年普洱茶。

1.3 培養(yǎng)基 MRS固體培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，瓊脂15 g，葡萄糖20 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，牛肉膏10 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蛋白胨10 g，吐溫1 mL，乙酸鈉5 g，K2HPO42 g，檸檬酸氫三胺2 g，蒸餾水定容至1 L，121℃高壓滅菌25 min。MRS液體培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基除去瓊脂。模擬胃液：NaCl 2 g，胃蛋白酶3.5 g，蛋白胨1.2 g，酵母膏3.1 g，無菌水定容至1000mL，1mol/LHCl調(diào)pH為3，用0.22μm濾菌膜除菌。模擬腸液：NaHCO311 g，NaCl 2 g，胰蛋白酶1 g，牛膽鹽1.2 g，無菌水定容至1000 mL，NaOH調(diào)pH為8.0，用0.22μm濾菌膜除菌。

1.4 樣品處理 樣品采集后放入4℃冰箱備用。各取1 g，每個(gè)樣品加入10 mL無菌水，充分振蕩獲得懸浮液，備用。1 mg DON標(biāo)準(zhǔn)品加入10 mL甲醛，4℃保存，作為母液備用。

1.5 具有降解DON目的菌富集與分離 接種環(huán)蘸取上述樣品混懸液劃線于含有DON（1 mg/L）固體培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中（好氧、厭氧兩種環(huán)境）倒置培養(yǎng)24 h，根據(jù)培養(yǎng)基上生長的形態(tài)不同單菌落，接種環(huán)挑取用于純培養(yǎng)。初篩得到的具有不同形態(tài)的單菌落，劃線到新的與其相對(duì)應(yīng)的固體培養(yǎng)基平板上，放置于相應(yīng)的培養(yǎng)環(huán)境中，反復(fù)純化3次，待平板上生長的菌落形態(tài)一致，接種環(huán)挑取單菌落，保存于濃度為30%的甘油中，4℃保藏，備用。純化之后的菌種接種含有1 mg/L DON液體培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，用DON ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)毒素的殘留量。

1.6 DON降解菌的鑒定 肉眼觀察MRS瓊脂平板上菌落，光學(xué)顯微鏡對(duì)具有降解DON能力的菌株MC-1進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。分子水平鑒定菌株MC-1使用ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC引 物 進(jìn) 行 擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果通過NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST搜索。所得序列使用MEGA 7.0程序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 菌株MC-1生物學(xué)特性試驗(yàn)

1.7.1 菌株MC-1生長曲線測(cè)定 菌株MC-1按2%接種量接入200 mL MRS液體培養(yǎng)基，混勻后測(cè)OD600值，同時(shí)吸取0.1 mL菌株培養(yǎng)液稀釋于0.9 mL無菌生理鹽水，10倍梯度稀釋。每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)。每隔2.0 h測(cè)OD600值和活菌數(shù)。以O(shè)D600值和活菌數(shù)（109cfu/mL）為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，GraphPad Prism8.0軟件制作菌株MC-1生長曲線。

1.7.2 菌株MC-1耐鹽試驗(yàn) 菌株MC-1按2%接種量接入NaCl（質(zhì)量濃度0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%）100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，在37℃搖床中180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。分別取各濃度菌株培養(yǎng)液0.1 mL稀釋于0.9 mL無菌生理鹽水，10倍梯度稀釋。每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)。

1.7.3 菌株MC-1耐膽鹽試驗(yàn) 菌株MC-1菌液接入含牛膽鹽（質(zhì)量濃度0.05%、0.1%和0.15%）100mLMRS液體培養(yǎng)基中，在37℃搖床中180r/min振蕩培養(yǎng)。分別在0、2.0、4.0、6.0、8.0 h取0.1 mL菌株培養(yǎng)液稀釋于0.9 mL無菌生理鹽水，10倍梯度稀釋。每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)。

1.7.4 菌株MC-1耐酸試驗(yàn) 菌株MC-1分別接入pH為2、3、4的100 mLMRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧靜置培養(yǎng)，分別在0、1.0、2.0、3.0 h取0.1 mL培養(yǎng)液，稀釋于0.9 mL無菌生理鹽水中，10倍梯度稀釋。每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)。

1.7.5 畢赤酵母菌MC-1模擬胃液和模擬腸液耐受性試驗(yàn) 畢赤酵母菌MC-1取10 mL，3000 r/min離心20 min，棄上清，無菌生理鹽水洗滌3次，洗滌結(jié)束后無菌生理鹽水重新懸浮。取菌懸液0.1 mL接入0.9 mL pH為3.0人工胃液中，37℃厭氧靜置培養(yǎng)；在0、1.0、2.0、3.0 h取0.1 mL培養(yǎng)液稀釋于0.9 mL無菌生理鹽水中，10倍梯度稀釋。每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)。上述處理后3.0 h培養(yǎng)液接種于人工腸液中，37℃厭氧靜置培養(yǎng)，分別于0、2.0、4.0、6.0、8.0 h吸取0.1 mL培養(yǎng)液稀釋于0.9 mL無菌生理鹽水中，10倍梯度稀釋。每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)。

1.7.6 菌株MC-1降解DON的活性成分定位試驗(yàn) 菌株MC-1培養(yǎng)液5 mL在4℃、6000 r/min條件下離心20 min；獲取無細(xì)胞上清液，低溫保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)超聲波破碎儀將菌體破碎，破碎后菌體用無菌PBS緩沖液清洗2次后，第3次用無菌PBS緩沖液重懸菌體碎片。經(jīng)上述處理后，無細(xì)胞上清液和菌體碎片加入DON（1μg/mL），含相同濃度DON無菌PBS緩沖液為空白對(duì)照，37℃、180 r/min恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)48 h，DON ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各處理組DON的殘留量。

1.8 菌株MC-1在飼料原料中降解DON試驗(yàn)從市面上購買的飼料原料分別有玉米粉、大豆粉和豆粕。飼料原料滅菌前進(jìn)行DON ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)毒素含量，飼料原料分成3份，每份100 g，密封放入高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌30 min。滅菌后飼料原料放入無菌錐形瓶，加入無菌水500 mL。將上述處理的飼料原料中加入600μg的DON純品和12 mL菌株MC-1菌液，添加完畢后混勻放入37℃恒溫箱靜置厭氧培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后用DON ELISA檢測(cè)試劑盒重復(fù)3次檢測(cè)毒素含量并計(jì)算結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 DON降解菌的篩選結(jié)果 普洱茶樣品初篩分離出18株在（1 mg/L DON）MRS培養(yǎng)基平板上生長的菌株，復(fù)篩得到7株DON降解率15.21%～59.21%菌株。如圖1所示7株菌其中MC-1經(jīng)過DON ELISA檢測(cè)試劑盒重復(fù)檢測(cè)3次之后DON降解率為59.21%。菌株MC-1菌落顏色呈灰白色，菌落邊緣不規(guī)則且略顯濕潤的菌落形態(tài)（圖2）。革蘭氏染色后菌體形態(tài)呈藍(lán)紫色米粒狀，因此確定菌株MC-1屬于革蘭氏陽性細(xì)菌（圖3）。菌株MC-1細(xì)菌基因組測(cè)序，所得基因序列在BLAST比對(duì)結(jié)果同源性系數(shù)與登錄號(hào)MN784687.1:32-442 Pichia sp.strain 1705親緣關(guān)系最相近，同源性達(dá)100%。MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并進(jìn)行序列比對(duì)分析，將分離目的菌株命名為畢赤酵母菌MC-1（圖4）。

圖1 復(fù)篩菌株DON的降解率

圖2 MC-1菌落形態(tài)

圖3 MC-1鏡檢菌體形態(tài)

圖4 MC-1同源性進(jìn)化樹

2.2 菌株MC-1生長曲線測(cè)定結(jié)果 菌株MC-1在培養(yǎng)0～6 h處于遲緩期，6.0～22.0 h時(shí)處于對(duì)數(shù)生長期，菌株在生長22～24 h處于穩(wěn)定期24 h之后出現(xiàn)衰亡期。菌株MC-1在生長24 h時(shí)達(dá)到最大活菌數(shù)8.87×1010cfu/mL（圖5）。

圖5 菌株MC-1生長曲線

2.3 菌株MC-1耐鹽試驗(yàn)結(jié)果 由圖6可知，菌株MC-1在鹽質(zhì)量濃度1%～7%培養(yǎng)24 h后，存活率依次為100%、80.2%、61.2%、33.5%、18.2%、5.6%、1.1%、0.012%，表明菌株MC-1對(duì)鹽溶液具有耐受性。

圖6 菌株MC-1耐鹽試驗(yàn)

2.4 菌株MC-1耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果 由圖7所示，MC-1在三種膽鹽濃度（0.05%、0.1%、0.15%）培養(yǎng)8.0 h后存活率分別為99.43%、76.88%、11.61%，表明菌株MC-1對(duì)膽鹽具有一定耐受能力。

圖7 菌株MC-1耐膽鹽試驗(yàn)

2.5 菌株MC-1耐酸試驗(yàn)結(jié)果 由圖8可知，菌株MC-1在pH分別為2、3、4培養(yǎng)3.0 h，菌株MC-1存活率分別為17.02%、35.28%、99.21%，表明菌株MC-1對(duì)酸性環(huán)境具有耐受性。

圖8 菌株MC-1耐酸試驗(yàn)

2.6 菌株MC-1模擬胃液試驗(yàn)結(jié)果 由表1所示，菌株MC-1在pH 3的模擬胃液中耐受0、1.0、2.0、3.0 h后存活率分別為100%、57.83%、36.64%、10.37%；菌株MC-1能夠在模擬胃液中存活。

表1 MC-1對(duì)模擬胃液的耐受性

2.7 菌株MC-1模擬腸液耐受性試驗(yàn)結(jié)果 由表2所示，菌株MC-1在pH 8的模擬胃液中耐受0、2.0、4.0、6.0、8.0 h后 存 活 率 分 別 為100%、63.58%、43.04%、25.76%、16.96%，表明菌株MC-1能夠在模擬腸液中存活。

表2 菌株MC-1對(duì)模擬腸液的耐受性

2.8 菌株MC-1降解DON的活性成分定位試驗(yàn)結(jié)果 如圖9所示，菌株MC-1的無細(xì)胞上清液DON降解率為54.76%，菌體裂解物DON降解率為23.73%，表明菌株MC-1無細(xì)胞上清液對(duì)DON發(fā)揮主要降解作用。

圖9 菌株MC-1不同活性成分對(duì)DON的降解率

2.9 菌株MC-1在飼料原料中降解嘔吐毒素試驗(yàn)結(jié)果 如圖10所示，菌株MC-1對(duì)玉米粉、大豆粉和豆粕DON降解率分別為29.60%、41.94%和46.79%，表明菌株MC-1能夠在飼料原料中降解DON。

圖10 菌株MC-1對(duì)不同飼料原料中DON的降解率

3 討論

本研究目的是運(yùn)用益生菌降解動(dòng)物飼料中的DON。人類使用酵母菌的歷史由來已久，酵母菌的使用改變了人類飲食結(jié)構(gòu)和生活方式。有研究報(bào)道從海底古沉船中打撈出酒壇樣品分離出釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae Hansen）（Thomast等，2021）。隨著人們對(duì)酵母菌的研究越來越深入且不斷發(fā)現(xiàn)酵母菌能夠產(chǎn)生很多有工業(yè)價(jià)值的生物活性物質(zhì)，有研究發(fā)現(xiàn)酵母菌能夠產(chǎn)生阿拉伯糖醇用于食品工業(yè)用的甜味劑（Agbogbo和Coward-Kelly，2008）。畢赤酵母菌能夠用于降解纖維素產(chǎn)生燃料酒精（Kordowska-Wiater，2015），南美洲國家巴西當(dāng)?shù)剡\(yùn)用酵母菌發(fā)酵甘蔗生產(chǎn)生物燃料（Ceccato-Antonini和Covre，2021）。

本研究分離出畢赤酵母菌MC-1的樣品來自普洱茶，茶葉發(fā)酵過程中需要益生菌參與發(fā)酵改變口感和風(fēng)味（Tian等，2014）。參與普洱茶發(fā)酵菌群具有多樣性，不同的細(xì)菌分泌不同的胞外物質(zhì)使得茶葉發(fā)生質(zhì)變（Niu等，2018）。畢赤酵母MC-1不僅能夠降解DON，還具有耐酸、耐膽鹽、生長24 h后達(dá)到最大活菌數(shù)，能夠在模擬胃液和模擬腸液中存活；有研究報(bào)道從酒曲中分離出畢赤酵母菌進(jìn)行體外益生試驗(yàn)后，斷奶仔豬體內(nèi)試驗(yàn)證明該菌能夠降低仔豬腹瀉（Ma等，2021；Lim等，2015）。畢赤酵母菌MC-1對(duì)鹽溶液耐受性相比乳酸菌而言較差，這可能與酵母菌屬于真核細(xì)菌有關(guān)。研究報(bào)道裂解多糖單加氧酶（LPMOs）在畢赤酵母菌中轉(zhuǎn)化表達(dá)之后在6%NaCl溶液中產(chǎn)酶可分解聚合纖維素（Patel等，2016）。本研究活性成分定位試驗(yàn)結(jié)果表明，無細(xì)胞上清液對(duì)DON起主要降解作用，其次是菌體裂解物。試驗(yàn)結(jié)果證明畢赤酵母菌MC-1可能有兩種機(jī)制降解DON。畢赤酵母菌MC-1菌體裂解物對(duì)DON具有吸附降解作用，目前有很多報(bào)道革蘭氏陽性菌和真菌對(duì)霉菌毒素具有吸附降解功能。這些細(xì)菌細(xì)胞壁主要成分含有肽聚糖和葡聚糖，這些是對(duì)DON構(gòu)成物理吸附的主要原因且本身對(duì)DON結(jié)構(gòu)沒有破壞（Zhai等，2019；Zoghi，2014）。無細(xì)胞上清液含有細(xì)菌分泌的胞外生物活性物質(zhì)，這些生物活性物質(zhì)使DON的化學(xué)結(jié)構(gòu)改變起到降解DON的作用。從麥田泥土中分離出一株能夠分泌（AKR18A1）醛酮還原酶降解嘔吐毒素的鞘氨醇單胞菌S3-4，該酶能夠通過連續(xù)發(fā)生酶反應(yīng)達(dá)到破壞DON化學(xué)結(jié)構(gòu)目的（He等，2017）。有研究報(bào)報(bào)道從土壤中分離出一株革蘭氏陰性菌德文菌16能夠高效降解DON，檢測(cè)其代謝產(chǎn)物是3-keto-DON（Wang等，2019）。酵母菌生長地同時(shí)不斷分泌有機(jī)酸導(dǎo)致上清液的pH降低（Guo等，2021）；DON在pH 2強(qiáng)酸環(huán)境能夠使DON脫環(huán)氧化形成DOM-1（Mishra等，2014）。隨著溶液酸堿度越低轉(zhuǎn)化率就越高，畢赤酵母菌MC-1上清液能夠降解DON可能與自身分泌有機(jī)酸有一定關(guān)系;酵母菌不僅能夠吸附污水中的重金屬、霉菌毒素，還具有抑制霉菌生長的作用（Garcia-Bejar等，2020）。本試驗(yàn)中，表明畢赤酵母菌MC-1在玉米粉、大豆粉和豆粕DON降解率分別為29.60%、41.94%、46.79%。益生菌作為食品和動(dòng)物飼料的微生物添加劑由來已久（余祖華和丁軻，2016），酵母菌發(fā)酵食品和飼料原料是一個(gè)緩慢厭氧放熱過程，原料中有機(jī)分子被生物活性物質(zhì)分解成簡單的有機(jī)質(zhì)，酵母菌因原料不同產(chǎn)酶量也不同（Aslam等，2020）。以上因素可能是造成畢赤酵母菌MC-1在飼料原料降解率不同的原因，其詳細(xì)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。本研究從普洱茶茶葉中分離出能夠降解DON的畢赤酵母菌MC-1且無細(xì)胞上清液能夠降解DON，這與絕大多數(shù)酵母菌吸附降解霉菌毒素有所不同。

4 結(jié)論

本研究以DON為唯一碳源分離到一株能有效降解DON的菌株MC-1，經(jīng)鑒定為畢赤酵母菌，該菌屬于真菌，革蘭氏陽性；具有耐酸、耐鹽、耐膽鹽和能夠在模擬消化液存活等生物學(xué)特性。菌株上清液主要發(fā)揮降解DON功能;能夠降解飼料原料中的DON，具有益生菌添加劑的潛力。