藍小媛，徐 瑤，張 偉，高 崧，郇長超

（揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州 225009）

1 自噬

細胞自噬（Autophagy）是一種廣泛存在真核生物中的細胞內降解過程，并在進化上高度保守（張林琳等，2021），其中產生自噬體能將長壽的蛋白質、蛋白質聚集物和受損的細胞器運送到溶酶體進行降解和循環(huán)。根據細胞物質運送到溶酶體的方式，自噬可以分為三種類型：巨自噬、微自噬和伴侶介導的自噬（Yu，2014），而通常說的自噬指的是巨自噬。細胞自噬的發(fā)生具有復雜性和動態(tài)性，與環(huán)境相關并受到嚴格的調控反應，涉及許多上游信號調控通路。自噬主要通過磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路進行誘導，而其他調控信號則是直接或間接通過這兩條通路發(fā)揮作用。多種細胞外和細胞內的刺激均可以誘導自噬（Miller等，2020），比如營養(yǎng)饑餓、內質網應激、病原體相關分子模式和病毒感染等過程。在病毒生命周期和疾病發(fā)病機制中病毒與宿主之間的相互作用起著重要作用，而巨自噬/自噬等細胞途徑被證明對病毒的復制和成熟是有害或有益的（Miller等，2020）。對機體是保護還是損害主要取決于應激的性質、細胞的類型和狀態(tài)。自噬在維持細胞平衡和內穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要的作用，研究已表明，自噬參與天然免疫應答和特異性免疫應答（高書峰等，2017），并且證明自噬基因的突變與各種疾病的發(fā)生存在關聯(lián)（Yu，2020）。

2 豬流行性腹瀉病毒

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）是冠狀病毒科甲型冠狀病毒屬的一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，可引起新生仔豬發(fā)生急性水樣腹瀉、嘔吐、脫水和高死亡率的高度傳染性疾病 （Jung等，2020），其主要感染豬小腸上皮細胞（Krishna等，2020）。PEDV的基因組長度約為28 kb，有一個5'帽和一個3'聚腺苷化的尾巴，其包含至少7個開放閱讀框（Kong等，2020；Yu等，2020），其中2/3的基因組包含兩個重疊的ORF，分別是ORF1a和ORF1b，它們編碼指導基因組復制、轉錄和病毒多蛋白加工的非結構蛋白，其余的PEDV基因組包含5個ORF，編碼4個結構蛋白和一個附屬蛋白（Lin等，2016），結構蛋白包括糖基化刺突（S）、包膜（E）、糖基化膜（M）和RNA結合核衣殼（N）蛋白（黃宗洋等，2022）。研究表明，S是最大的結構蛋白，其氨基酸的變化會影響PEDV的毒力和致病性，而且S基因突變廣泛，因此常被用作病毒遺傳變異分析的靶基因（Yu等，2020）。N蛋白是病毒顆粒中含量最豐富的蛋白質，其為病毒基因組周圍的螺旋核衣殼提供了結構基礎，N蛋白參與病毒的多種生物和免疫活動。M和E蛋白通過組裝形成病毒包膜。

3 自噬與豬流行性腹瀉病毒的相互作用

3.1 豬流行性腹瀉病毒誘導自噬 自噬不僅是一種自我降解的生理細胞途徑，也是一種保護宿主細胞免受病原體感染的防御機制，當病原體入侵機體，細胞通過將病原體運輸到溶酶體進行清除。研究發(fā)現PEDV的結構蛋白（S、M、E、N）不足以觸發(fā)自噬，而PEDV的非結構蛋白6（nsp6）和ORF3能夠誘導豬腸上皮細胞（IPEC-J2）發(fā)生明顯的自噬（Lin等，2020）。因此，nsp6和ORF3是PEDV誘導自噬的兩個關鍵因子。

3.1.1 PEDV通過內質網應激誘導自噬 錯誤折疊的蛋白質在內質網腔內積累，觸發(fā)未折疊蛋白反應（UPR）以恢復穩(wěn)態(tài)，這種情況被定義為內質網應激（黃宗洋等，2022）。許多冠狀病毒科在復制過程中，會產生大量的病毒跨膜糖蛋白來誘導內質網應激反應（Xu等，2013；Minakshi等，2009），Zou等（2019）啟動了多種表達PEDV的ORF3蛋白的重組質粒的構建，并發(fā)現ORF3以聚集的方式定位于細胞質中，PEDV的ORF3蛋白也是一種定位于內質網的跨膜蛋白。Sun等（2021）研究發(fā)現，PEDV感染可以誘導內質網應激，并通過蛋白激酶R樣內質網激酶（PERK）、肌醇依賴酶（IRE）信號通路激活自噬，內質網應激和自噬在機制上是相互關聯(lián)的。經研究證明ORF3通過上調葡萄糖調節(jié)蛋白78（GRP78）和激活PERK-真核翻譯起始因子2α（eIF2α）信號通路觸發(fā)內質網應激，同時PEDV的ORF3蛋白可以通過誘導LC3-I向LC3-II的轉化來誘導自噬，相比之下，內質網應激抑制劑4-PBA可顯著抑制LC3-I/LC3-II的轉化，說明PEDV的ORF3蛋白誘導的自噬依賴于內質網應激反應（Zou等，2019）。同時累積的活性氧（ROS）在PEDV感染過程中調節(jié)內質網應激介導的自噬發(fā)揮了重要作用（Surviladze等，2013）。

3.1.2 PEDV通過PI3K/Akt/mTOR誘導自噬PEDV屬于冠狀病毒科甲型冠狀病毒屬，冠狀病毒nsp6是一種完整的膜蛋白，被認為參與了雙膜囊泡（DMV）的形成，冠狀病毒nsp6蛋白通過一個巨大的中間體從內質網產生自噬體，并激活自噬（Cottam等，2011），已有研究表明，nsp6也可促進PEDV自噬，但nsp6誘導自噬的機制尚不清楚。研究表明，PI3K/Akt/mTOR信號通路在自噬過程中起著至關重要的作用（Surviladze等，2013；Saiki等，2011）。Lin等（2016）通過分析nsp6表達的IPEC-J2細胞中未磷酸化和磷酸化的mTOR、P70S6激酶（p70S6K）和p53的表達發(fā)現，nsp6通過PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導自噬，通過干擾RNA實驗進一步證實了自噬與PEDV復制的關系。內源性p53基因被特異性沉默，與模擬處理組相比，干擾RNA介導的p53表達沉默降低了病毒滴度。這些數據也證明PEDV觸發(fā)的自噬是通過PI3K/Akt/mTOR信號通路進行的 （Cottam等，2011）。

3.2 自噬促進豬流行性腹瀉病毒復制 自噬是一種內在的宿主防御機制，但隨著病毒的進化，已經發(fā)展出許多機制來阻止自噬，甚至利用自噬使其有利于自身的發(fā)展，如今自噬被認為是病毒復制的平臺（Guo等，2017）。冠狀病毒科成員的復制機制各不相同，例如傳染性支氣管炎病毒能夠誘導自噬，但不需要自噬來進行復制（Maier等，2013）；傳染性胃腸炎病毒感染誘導自噬，自噬負調控其復制（Guo等，2016）。

為了確定自噬與PEDV復制的關系，Lin等（2020）使用自噬增強劑和自噬抑制劑來檢測自噬對PEDV復制的影響。羥基氯喹可以通過阻斷自噬體與溶酶體的融合來抑制自噬，早期用羥氯喹抑制自噬可抑制PEDV感染，雷帕霉素通過抑制mTOR信號通路誘導自噬，而雷帕霉素誘導自噬可使病毒滴度升高。這些結果表明，自噬增強了PEDV在IPEC-J2細胞中的復制（范浩天，2019；Cottam等，2011），因此自噬有助于PEDV復制。Surviladze等（2013）以自噬誘導劑雷帕霉素（1 μM）和自噬抑制劑3-MA（5 mM）作為對照，應用PERK和肌醇依賴酶1（IRE1）抑制劑驗證內質網應激介導的自噬對PEDV復制的影響，結果表明PEDV通過PERK和IRE1通路誘導自噬從而促進病毒復制（Surviladze等，2013）。細胞自噬如何促進PEDV復制的分子機制還有待進一步的研究。

4 小結

自噬是一種必要的細胞自降解過程，在維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)和能量平衡發(fā)揮著重要的作用，還與多種疾病的發(fā)生存在關聯(lián)。目前對自噬的研究范圍非常廣泛，涉及腫瘤學、神經病學、心血管系統(tǒng)、內分泌、外科、泌尿系和消化系統(tǒng)等。自噬一方面具有抗病毒和抗炎作用，但另一方面它們被病毒進化來抑制、逃逸或操縱各自的宿主成分，病毒可能會出于自身優(yōu)勢而觸發(fā)自噬促進復制。PEDV作為一種豬腸道冠狀病毒，具有高度傳染性，給全球養(yǎng)豬場帶來了巨大的經濟損失。目前研究證明PEDV主要是通過非結構蛋白nsp6和ORF3誘導自噬，nsp6通過激活內質網應激誘導自噬，ORF3通過PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導自噬，目前關于自噬與PEDV之間的相互作用機制研究較少，研究自噬與PEDV感染之間的相互作用，進一步了解PEDV的致病機制，為PEDV的治療和抗病毒藥物的研發(fā)提供新的解決途徑和思路。同樣屬于冠狀病毒科的新型嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2型（SARS-CoV-2），在2019年引發(fā)全球爆發(fā)新型冠狀病毒肺炎（COVID-19），極大的影響了醫(yī)療和社會經濟，給人類帶來了極大的挑戰(zhàn)，迅速成為全球公共衛(wèi)生緊急事件（Mijaljica等，2020）。直到現在仍然沒有研制出有效的抗擊新冠肺炎藥物，研究表明自噬與SARSCoV-2同樣具有復雜的關系，自噬可以作為抗SARS-CoV-2感染的一種新策略，為治療新冠肺炎提供新的方法和思路。