蒙自己 黎喜平 唐東昕 姜運瓊 何 靜 肖淦辰

（1.貴州中醫(yī)藥大學碩士研究生2000 級，貴州 貴陽 550002；2.貴州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，貴州 貴陽 550002；3.貴州中醫(yī)藥大學護理學院，貴州 貴陽 550002）

椎動脈型頸椎?。–ervical spondylosis of vertebral artery type，CSA）是臨床常見疾病，以椎動脈刺激或者受壓后出現(xiàn)椎-基底動脈缺血而出現(xiàn)的系列癥狀：頭暈、頭痛、耳鳴、視力障礙、平衡障礙、聽力減退等[1，2]。目前西醫(yī)治療無效果確切的具體方法，如藥物治療只是對癥處理，暫時緩解癥狀，對原發(fā)病沒有作用，而手術雖然可以處理原發(fā)病但是風險高、創(chuàng)傷大，不能為廣大患者接受，另由于手術未針對病因治療，長期療效難以保證[3]。

苗族醫(yī)藥是苗族人民在長期與疾病斗爭的實踐中產生的，擁有一系列具有民族特色的醫(yī)理理論、用藥理論、診法理論、治法理論及預防理論，經(jīng)苗醫(yī)學科收集的苗醫(yī)隔藥紙火灸法（是集火療、藥療于一體的復合療法，該法用料由火、科室自制黑骨藤追風液、紗布、草紙4 個部分組成）經(jīng)長期臨床實踐對頸椎病療效確切[4]。目前研究表明[5，6]CAS 發(fā)病機制與椎-基底動脈缺血相關，其缺血機制之一與體內SOD 降低致過氧化物（以MDA 為代表）過高，脂質代謝異常后椎動脈血管壁損傷有密切聯(lián)系。因此，課題組擬通過CSA 兔模型之SOD、MDA 及椎動脈血管形態(tài)學等指標觀測以初步揭示苗醫(yī)隔藥紙火灸法治療機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 新西蘭大白兔9 只，2～2.5 kg，雄性，普通級，許可證號：SCXK 贛2018-0009，江西省贛州市畜牧研究所，溫度20～26 ℃，濕度40%～70%。實驗試劑與儀器：黑骨藤追風液（組方：黑骨藤500 g，活麻根250 g，小血藤250 g，透骨香250 g，四塊瓦250 g，追風傘250 g，將其全部浸泡于3500 mL 55°米酒中1 個月后備用）；消痔靈注射液（吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司，國藥準字Z22026175）；頸部阻燃棉；超凈高級封片膠（YZB，BASO）；伊紅染色液（G1100，Solarbio）；Scott 藍化液（G1865，Solarbio）；藥品冷藏柜（BYC-310，山東博科生物產業(yè)有限公司）；顯微鏡（CX41 OLYMPUS）；切片機（2235，Leica）；D31（NB600-562SS，Novus）；VEGF（19003-1-ap，proteintech）；辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L）（ZB-2301，中杉金橋）；DAB 顯色試劑盒（CW0125，CWBIO）；中性樹脂（CW0136，CWBIO）；蘇木素染色（AR1180-1，博生德生物產業(yè)有限公司）。藥品冷藏柜（BYC-310，山東博科生物）；SOD 活性檢測試劑盒（BC0170，Solarbio）；MDA 含量檢測試劑盒（BC0020，Solarbio）。

1.2 模型制備及分組 實驗分為3 組正常對照組（Control）、CSA 模型組（Model）、苗醫(yī)隔藥紙火灸法治療組（Treatment），每組3 只，所有兔子先用脫毛劑將左側自枕后及頸部的體毛脫掉。除正常組均常規(guī)構建椎動脈型頸椎病兔模型[7]，之后進行局部麻醉。抽取硬化劑消痔靈注射液10 mL 注射于兔左側C3～C5頸椎橫突側面，分別于第2、4、6、8 周重復注射1 次，以造成兔椎動脈周圍形成無菌性炎癥及瘢痕組織，從而造成椎動脈型頸椎病動物模型。造模后苗藥治療組進行干預處理，固定模型兔為俯臥位，暴露頸部，皮膚消毒，將裝有藥液的容器瓶放入40 ℃左右的溫水中進行加熱處理，將加熱的藥液倒入彎盤中，再放6 層紗布充分吸收藥液，將吸收藥液的紗布平鋪于關節(jié)面上，再七層草紙熱水浸潤平鋪于藥液紗布上，周圍覆上阻燃棉保護非治療區(qū)域，用直鉗夾持浸有95%酒精的燃燒棉球，在紗布上做“蜻蜓點水”狀連續(xù)敲擊，持續(xù)1～2 min，用保鮮膜覆在敲擊部位上進行保溫2～3 min，再次點燃棉球進行敲擊加溫的動作，重復4 次，每次5 min，共治療20 min，隔日治療1 次，每周3 次，在造模后的第8、10、12、14、16、18、20、22、24 天，各治療1 次，共治療9 次。干預后處死各組兔子，取頸部肌肉組織，進行HE 染色后分析椎動脈血管壁中膜厚度，取外周血樣本，生化試劑盒檢測其中SOD 和MDA 的水平。

1.3 HE染色 取出組織流水沖洗數(shù)小時，經(jīng)70%、80%、90%各級乙醇溶液脫水，純酒精、二甲苯等量混合液15 min，二甲苯Ⅰ15 min、二甲苯Ⅱ15 min（至透明為止）。放入二甲苯和石蠟各半的混合液15 min，再放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各50～60 min。石蠟包埋，切片。將石蠟切片進行烤片，然后脫蠟，水化。將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色3 min，鹽酸乙醇分化液分化15 s，稍水洗，返藍液返藍15 s，流水沖洗，伊紅染色3 min，流水沖洗，脫水，透明，封片，鏡檢。

1.4 生化檢測 所有試劑和組分都先恢復到室溫，標準品和樣品，做復孔。配制好試劑盒各種組分的工作液，可按試劑盒說明書中試劑準備中描述的方法操作。

分光光度計預熱30 min 以上，調節(jié)波長至560 nm，蒸餾水調零。SOD 測定前將試劑一、三和五7 ℃（哺乳動物）或25 ℃（其他物種）水浴5 min 以上。樣本測定，充分混勻，37 ℃水浴30 min 后，置于1 mL 玻璃比色皿測定560 nm 下的吸光度，分別記為A 測定、A 對照、A1 空白、A2 空白，計算ΔA 測定=A 測定-A 對照，ΔA空白=A1 空白-A2 空白。如底部有沉淀，混勻后再行測定。全自動酶標儀（WD-2102B，北京六一）儀器預熱30 min 以上，蒸餾水調零，按照表格加樣，混合液在100 ℃水浴中保溫60 min 后（蓋緊，防止水分散失），置于冰浴中冷卻，10 000 g，常溫，離心（上海盧湘儀離心機儀器有限公司，型號TGL-16.5M，半徑6.26 cm，3500 r/min）10 min。取上清至1 mL 玻璃比色皿中，測定各樣本在450 nm、532 nm 和600 nm 處的吸光度，分別計算ΔA450=A450 測定-A450 空白，ΔA532=A532 測定-A532 空白，ΔA600=A600 測定-A600 空白。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析。所有實驗重復3 次，定量結果采用（）表示。顯著性分析采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 病理檢查觀察椎動脈血管形態(tài) HE 結果可以看出，與正常對照組相比，模型組動脈中膜平滑肌細胞肥大，血管內皮皺褶排列紊亂；與模型組相比，苗醫(yī)隔藥紙火灸法組管壁中膜平滑肌細胞肥大明顯受到抑制，血管內皮皺褶較勻稱。見圖1。

圖1 兔子椎動脈型頸椎血管形態(tài)（HE染色）

2.2 生化檢測 與正常對照組比較，模型組MDA 含量明顯增加，苗醫(yī)隔藥紙火灸法組含量明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；與正常對照組比較，模型組SOD 含量明顯減少，而苗醫(yī)隔藥紙火灸法組SOD 含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 生化檢測椎動脈SOD和MDA含量

3 討論

苗醫(yī)無“頸椎病”的病名記載，病名分類不如中西醫(yī)細致，常將頸椎病歸屬于“風類疾病”（指因風寒濕毒入侵所導致疼痛、腫脹、痙攣甚至眩暈為主的一類疾?。?。苗醫(yī)認為氣、血、水構成人體三要素，也是形成頸椎間盤、椎骨、血脈及肌肉的物質基礎。由于毒和亂影響人體，惠氣的運化、防病能力減弱，血液的生成及運行發(fā)生障礙，局部組織濡養(yǎng)不足，毒素不得清除而留滯，氣血水運行受阻，氣血水不能通過筋脈滋養(yǎng)頸部組織，能量不足則使得頸項部椎動脈供血不足，最終導致椎動脈型頸椎病的發(fā)生。

苗醫(yī)隔藥紙火灸作為體現(xiàn)“四大筋脈學說”苗醫(yī)理論的經(jīng)典特色療法，它結合藥療、火療于一體，取火性通散，藥性祛毒的原理而成。在治療部位覆蓋浸泡過藥液的紗布和草紙，通過火把持續(xù)敲打促使黑骨藤追風藥液更有效滲入疼痛部位，從而將筋脈內留滯的寒邪排出體外，達到通氣散血止痛的目的，也體現(xiàn)“氣以通為用，血以散為安”的苗醫(yī)治療理念。

本研究苗醫(yī)隔藥紙火灸法所采用的黑骨藤追風液由黑骨藤、小血藤、活麻根、透骨香、追風傘、四塊瓦及米酒配制而成。方中的領頭藥（苗醫(yī)配方將藥物分為領頭藥、鋪底藥和監(jiān)護藥，與中藥配方之“君、臣、佐使”異曲同工）為黑骨藤、小血藤、活麻根，均為根莖部入藥，具有舒經(jīng)活絡，除濕止痛作用；鋪底藥為透骨香、追風傘、四塊瓦，均為全草入藥，具有除濕通絡止痛之效，增強領頭藥除濕止痛之功效；監(jiān)護藥米酒性熱，緩解領頭藥、鋪底藥的劣性和毒副作用，同時引藥入經(jīng)，督促諸藥共達病所。

本研究結果表明苗醫(yī)隔藥紙火療法對椎動脈型頸椎病模型兔治療后，可明顯促使體內血清MDA 含量明顯減少、SOD 含量明顯增加，從組織形態(tài)學也證實其對損傷的椎動脈管壁有修復作用。初步揭示了苗醫(yī)隔藥紙火灸法治療椎動脈型頸椎病的機制，本療法在操作步驟上易于掌握，值得進一步推廣。